張曉靜，叢 斌

(河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050017)

近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)一氧化氮(nitric oxide，NO)可對(duì)半胱氨酸巰基(－SH)進(jìn)行氧化修飾，生成低分子量的亞硝基硫醇(RSNO)和高分子量的亞硝基化蛋白質(zhì)(S－nitrosylated protein，PSNO)，前者包括亞硝基半胱氨酸(S－nitrosocysteine，CyS－SNO)和亞硝基谷胱甘肽(S－nitrosoglutathione，GSNO)，后者又稱蛋白質(zhì)巰基亞硝基化(protein S－nitrosylation)。蛋白質(zhì)巰基亞硝基化可改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能，被認(rèn)為是一種與磷酸化相似的新的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控方式，在許多生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。本文就蛋白質(zhì)巰基亞硝基化(簡(jiǎn)稱亞硝基化)對(duì)細(xì)胞功能的調(diào)控作用作一綜述。

1 亞硝基化作用的概述

亞硝基化作用是一種可逆性的蛋白質(zhì)巰基氧化修飾方式，其修飾產(chǎn)物PSNO較穩(wěn)定，比NO的半衰期長(zhǎng)，但在強(qiáng)光、金屬離子和還原性物質(zhì)如還原型谷胱甘肽、抗壞血酸鹽等的作用下易分解。PSNO可根據(jù)生命活動(dòng)的需要及時(shí)釋放NO，當(dāng)NO過(guò)量產(chǎn)生時(shí)又可迅速貯存NO，因此亞硝基化修飾被認(rèn)為是機(jī)體儲(chǔ)存、釋放和運(yùn)輸NO的主要方式。NO對(duì)蛋白質(zhì)的亞硝基化不是NO與蛋白質(zhì)分子之間的簡(jiǎn)單結(jié)合，而是由一系列復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)組成。首先，NO與氧反應(yīng)產(chǎn)生一系列氮氧化物如三氧化二氮(N2O3)或四氧化二氮(N2O4)，這些氮氧化物可直接對(duì)含自由巰基蛋白質(zhì)(用RSH表示)進(jìn)行亞硝基化。化學(xué)反應(yīng)式為:N2O3+RSH→RSNO+NO2－+H+［1］。第二，NO基團(tuán)可在亞硝基化蛋白質(zhì)與自由巰基之間快速交換，即轉(zhuǎn)亞硝基作用?；瘜W(xué)反應(yīng)式為:R1SH+R2SNO→R1SNO+R2SH［2］。第三，亞硝基化蛋白質(zhì)還可進(jìn)一步與自由巰基反應(yīng)產(chǎn)生分子間二硫鍵和硝酰基(HNO)。化學(xué)反應(yīng)式為:RSNO+RSH→RSSR+HNO［3］。綜上，亞硝基化可直接調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能，也可通過(guò)形成二硫鍵等與NO相關(guān)的巰基氧化修飾間接調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能。

2 機(jī)體調(diào)節(jié)亞硝基化的機(jī)制

機(jī)體內(nèi)存在一些酶可以對(duì)亞硝基化進(jìn)行調(diào)節(jié)。目前研究比較多的酶主要有3種:一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)、硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)和亞硝基谷胱甘肽還原酶(S－nitrosogluthathione reductase，GSNOR)。其中Trx廣泛存在于各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，可以水解亞硝基化蛋白，引起去亞硝基化，維持細(xì)胞內(nèi)亞硝基化穩(wěn)態(tài)［4］。GSNOR可降解GSNO產(chǎn)生谷胱甘肽二硫鍵(GSSG)、N－羥基亞磺酰胺(GSNHOH)和銨離子(NH4+)，化學(xué)反應(yīng)式為:GSNOGSNHOH+GSSG+NH4+。GSNOR基因敲除的小鼠體內(nèi)亞硝基化水平明顯升高，證實(shí)了GSNOR在維持亞硝基化穩(wěn)態(tài)方面的重要性［5］。此外，血漿銅藍(lán)蛋白和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase，PDI)也參與了亞硝基化作用［6，7］。目前還未發(fā)現(xiàn)特異性調(diào)節(jié)亞硝基化修飾的酶。

亞硝基化除了受酶調(diào)節(jié)外還與許多非酶因素有關(guān)。研究結(jié)果表明，在能被亞硝基化的蛋白質(zhì)中只有少數(shù)蛋白質(zhì)富含半胱氨酸，蛋白質(zhì)中自由巰基過(guò)多或排列過(guò)度緊密，會(huì)影響單個(gè)巰基的亞硝基化［8］。堿性氨基酸和酸性氨基酸之間構(gòu)成疏水環(huán)境，有利于蛋白質(zhì)間的相互作用。研究證實(shí)，被亞硝基化的半胱氨酸主要存在于堿性氨基酸和酸性氨基酸之間［9］。有趣的是，在細(xì)胞內(nèi)與NO合酶共定位的蛋白較其它蛋白更易發(fā)生亞硝基化［10］。此外，細(xì)胞內(nèi)NO濃度、細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)、蛋白所處的微環(huán)境也可以影響亞硝基化作用。

3 亞硝基化參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

3.1 亞硝基化對(duì)離子通道的調(diào)控 研究發(fā)現(xiàn)，心肌NOS產(chǎn)生的NO可使心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)膜上的雷諾丁受體鈣離子釋放通道(ryanodine receptor Ca2+release channel)亞硝基化，促進(jìn)通道開(kāi)放，增加胞漿內(nèi)Ca2+濃度［11］。另有研究證實(shí)，海馬電壓門(mén)控式Ca2+通道發(fā)生亞硝基化后，Ca2+電流增加［12］。此外，鉀離子通道和鈉離子通道也可以發(fā)生亞硝基化修飾［13，14］。這些研究表明，亞硝基化修飾參與離子通道相關(guān)的生命活動(dòng)如物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、肌肉收縮、神經(jīng)沖動(dòng)傳遞等。

3.2 亞硝基化對(duì)膜受體功能的調(diào)節(jié) G蛋白偶聯(lián)受體(G protein－coupled receptors，GPCRs)存在于所有的真核細(xì)胞中，是膜受體中最大的家族，可接受神經(jīng)遞質(zhì)、脂質(zhì)介質(zhì)及激素類物質(zhì)等傳遞的信號(hào)，激活后生成第二信使，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)先用NO供體GSNO孵育大鼠肺動(dòng)脈可以使動(dòng)脈組織α1腎上腺素能受體亞硝基化，與配體結(jié)合能力減弱，從而抑制兒茶酚胺誘導(dǎo)的血管收縮［15］。另有研究證實(shí)，NO供體硝普鈉處理HEK－293細(xì)胞可對(duì)血管緊張素受體進(jìn)行亞硝基化，降低其配體與受體親和力［16］。GPCRs介導(dǎo)的信號(hào)通路可以產(chǎn)生 NO，相反NO可通過(guò)對(duì)GPCRs亞硝基化降低GPCRs與配體的親和力，抑制GPCRs介導(dǎo)的信號(hào)通路，形成負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)路，這對(duì)于調(diào)控GPCRs通路相關(guān)的細(xì)胞活動(dòng)具有重要意義。受體酪氨酸激酶是膜受體的另一個(gè)大家族，這類受體所識(shí)別的信號(hào)蛋白統(tǒng)稱為生長(zhǎng)因子。研究證實(shí)，表皮生長(zhǎng)因子受體亞硝基化后與配體的親和力降低，表明亞硝基化具有抗細(xì)胞增殖作用［17］。磷酸化是GPCRs和受體酪氨酸激酶的主要調(diào)節(jié)機(jī)制，上述研究結(jié)果提示，亞硝基化是繼磷酸化之后調(diào)節(jié)GPCRs和酶偶聯(lián)受體的新機(jī)制。此外，還有其它膜受體如死亡受體和Toll樣受體等均可以發(fā)生亞硝基化［18，19］。

3.3 亞硝基化對(duì)激酶活性的影響 蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)廣泛分布于哺乳動(dòng)物各器官、組織和細(xì)胞中，對(duì)細(xì)胞的代謝、生長(zhǎng)、增殖和分化起著重要的調(diào)節(jié)作用。PKC的C1區(qū)包含1個(gè)富含半胱氨酸的“鋅指”結(jié)構(gòu)，該區(qū)域內(nèi)的半胱氨酸處于疏水環(huán)境易受巰基修飾劑的影響。Gopalakrishna等［20］證實(shí)，NO供體亞硝基化半胱氨酸(CyS－SNO)可抑制PKC磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，NO清除劑或巰基還原劑可逆轉(zhuǎn)CyS－SNO的效應(yīng)。絲裂原蛋白活化激酶(mitogen－activated protein MAP kinases，MAPK)家族包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular－signal regulated kinase，ERK)、c－JUN 氨基末端激酶(c－Jun NH2－terminal kinase，JNK)和 p38MAPK。Park等［21］證實(shí)，低濃度NO可使JNK發(fā)生亞硝基化并抑制激酶活性，認(rèn)為NO對(duì)JNK活性的抑制作用有利于機(jī)體抵抗紫外線、熱休克、DNA損傷物質(zhì)的毒性作用。

3.4 亞硝基化對(duì)轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合活性的影響核因子 －κB(nuclear factor－κB，NF－κB)是一類存在于多種細(xì)胞，與炎癥和免疫應(yīng)答相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，它調(diào)控的基因表達(dá)產(chǎn)物主要包括致病因子和炎癥介質(zhì)如NOS合酶、細(xì)胞因子、細(xì)胞因子受體以及黏附分子等，在炎癥反應(yīng)的調(diào)控中起核心作用。Matthews等［22］發(fā)現(xiàn)，NO可對(duì)NF－κB的p50亞基進(jìn)行亞硝基化，抑制p50的DNA結(jié)合活性。另有研究結(jié)果表明，亞硝基硫醇可通過(guò)阻止IκB降解或促進(jìn)其mRNA轉(zhuǎn)錄發(fā)揮抑制NF－κB活性的作用［23］?；罨鞍祝?(activator protein－1，AP－1)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞增殖和凋亡，在機(jī)體抵抗炎癥反應(yīng)的過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。Nikitovic等［24］證實(shí)，NO可對(duì)AP－1的亞基c－Jun第272位半胱氨酸和亞基c－Fos第154位半胱氨酸進(jìn)行亞硝基化，改變AP－1的活性。cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element－binding protein，CREB)的活化是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜組織增生過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，我室研究發(fā)現(xiàn)，NO可通過(guò)引起滑膜細(xì)胞內(nèi)亞硝基化，導(dǎo)致CREB發(fā)生可逆性巰基氧化修飾，并抑制其DNA結(jié)合活性［25］。含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)巰基氧化修飾具有敏感性，此類轉(zhuǎn)錄因子被亞硝基化可使鋅離子釋放，蛋白質(zhì)變構(gòu)。轉(zhuǎn)錄因子Sp1和早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子作為含鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子分別在腫瘤細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，研究證實(shí)，亞硝基化可使兩者的DNA結(jié)合活性降低，提示亞硝基化對(duì)于腫瘤細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞增殖可能具有抑制作用［26］。缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia－inducible factors，HIF)在缺氧狀態(tài)下被激活，啟動(dòng)一系列對(duì)缺氧敏感的基因的表達(dá)，參與缺氧反應(yīng)。第533位半胱氨酸是NO對(duì)HIF活性調(diào)節(jié)的靶點(diǎn)，HIF亞硝基化可增強(qiáng)其活性，參與缺血條件下心肌保護(hù)［27］。越來(lái)越多的轉(zhuǎn)錄因子可以被亞硝基化修飾，提示亞硝基化在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，研究轉(zhuǎn)錄因子亞硝基化在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用將為癌癥、炎癥等疾病的防治提供新的措施。

4 亞硝基化參與細(xì)胞凋亡

許多參與細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)都可以發(fā)生亞硝基化。Caspase－3是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，在生理狀態(tài)下，caspase－3發(fā)生亞硝基化活性降低，不能啟動(dòng)凋亡;當(dāng)?shù)蛲鲂盘?hào)傳入后使亞硝基的caspase－3去亞硝基化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［28］。B細(xì)胞淋巴瘤/白血病－2(B －cell lymphoma/leukemia－2，Bcl－2)蛋白是第一個(gè)被確認(rèn)有抑制凋亡作用的蛋白，Bcl－2蛋白亞硝基化可增強(qiáng)其抗凋亡活性。相反，有些蛋白質(zhì)發(fā)生亞硝基化后可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。例如，3－磷酸甘油醛脫氫酶亞硝基化可使其核轉(zhuǎn)位，誘導(dǎo)p53表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［29］。線粒體分裂蛋白－1亞硝基化可以誘導(dǎo)線粒體分裂，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［30］。綜上，亞硝基化對(duì)細(xì)胞凋亡具有雙向調(diào)節(jié)作用，這取決于細(xì)胞類型、細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)及NO的濃度。

5 亞硝基化參與炎癥反應(yīng)

近年來(lái)亞硝基化的抗炎作用逐漸受到人們的重視。研究發(fā)現(xiàn)，在給小鼠應(yīng)用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)之前吸入NO供體亞硝酸乙酯，可增加氣道組織亞硝基化蛋白質(zhì)表達(dá)水平，抑制LPS誘導(dǎo)的NF－κB的活性并減輕肺臟炎性病理改變［31］。NO供體型非甾體抗炎藥(NO－NSAIDs)成為近年來(lái)抗炎藥物研究的重點(diǎn)。NO－NSAIDs可以直接抑制NF－κB活性或通過(guò)抑制 IκB降解阻礙 NF－κB活化［32，33］。此外，NO － NSAIDs可通過(guò)亞硝基化抑制半胱氨酸水解酶活性，減少I(mǎi)L－1、IL－6和TNF等炎性因子生成，抑制炎癥反應(yīng)［34］。這些研究表明，亞硝基化具有重要的抗炎作用。

6 展望

亞硝基化正逐步被認(rèn)為是一種與磷酸化相似的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控方式，但其反應(yīng)特性、調(diào)控機(jī)制及生物學(xué)意義等方面都不十分清楚，均有待深入研究。隨著對(duì)蛋白質(zhì)亞硝基化作用研究的不斷深入，人們對(duì)NO的生物學(xué)效應(yīng)將有更加全新的認(rèn)識(shí)，對(duì)氣體信號(hào)分子在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)快速調(diào)節(jié)中的作用有更深層次的了解。

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