丁 鏟

(中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，200241)

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是副黏病毒科副黏病毒亞科禽腮腺炎病毒屬的成員之一，也是家禽的主要病原之一。NDV病毒粒子自然狀態(tài)下呈多形性，大小150 nm～400 nm；病毒粒子內有長1000 nm螺旋狀的核衣殼結構，直徑為17 nm～18 nm；囊膜上覆蓋有直徑8 nm～12 nm的糖蛋白纖突。NDV基因組為單股負鏈RNA，分子量 5.2×106～5.7×106道爾頓。NDV基因組包括6個基因(3'-NP-P-M-F-HN-L-5')編碼至少8種蛋白(6種結構蛋白，和由P蛋白基因經RNA編輯，從移碼了的閱讀框翻譯出2種非結構蛋白V和W蛋白)。目前已知的基因組長度分別有3類，ClassⅡⅠ-Ⅳ型 NDV為15186 nt，ClassⅡ基因型V-IX型為15192 nt，而 ClassⅠ為15198 nt[1]?；蚪MRNA兩端還有順反子外片段：3'端引導(Leader)序列及5'端尾隨(Trailer)序列，這些區(qū)域是病毒復制所必需的。在各基因的前后端有保守的轉錄調控片段，分別為基因起始端和基因末端。NDV的基因組非常高效，約95%用來編碼病毒結構蛋白?；蚝突蜷g有1個～47個核苷酸不等的基因間片段。螺旋狀的核衣殼是RNA復制的模板，核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein，NP)與基因組RNA共同組成了核心結構，磷蛋白(Phospho protein，P)和大蛋白(Large protien，L)附著在核心結構上，共同組成了RNP或轉錄復制復合物作為最小感染單位。NDV囊膜上有兩種表面糖蛋白：血凝素-神經氨酸酶(Hemagglutinin-neuraminidase，HN)蛋白和融合(Fusion protien，F(xiàn))蛋白，前者參與宿主細胞的吸附，后者通過與細胞膜的融合侵入宿主細胞。F和HN蛋白也是NDV引發(fā)免疫反應的主要保護性抗原蛋白。病毒囊膜內側為基質(Matrix protien，M)蛋白，能抑制宿主細胞基因的轉錄和翻譯，破壞宿主細胞的骨架結構，參與病毒的組裝和釋放。通過RNA編輯途徑翻譯的兩種非結構蛋白V和W，前者主要抑制宿主細胞干擾素的產生，有利于病毒復制；后者的功能目前還不是很清楚。

在感染過程中，NDV吸附蛋白HN首先與敏感細胞表面的唾液酸受體結合，這種結合作用可以引起吸附蛋白HN和融合蛋白F構象發(fā)生變化，后者的融合肽被釋放出來，使病毒的囊膜與細胞膜發(fā)生融合，釋放核衣殼化的基因組RNA和RNA聚合酶到胞質中；然后在胞質中進行mRNA的轉錄和翻譯、基因組的復制和病毒的組裝[2]。

就負鏈RNA病毒而言，能否形成RNPs結構是NDV復制增殖的關鍵所在，其具有功能活性的最小單位為RNP復合結構[3]。該結構由病毒的基因組RNA與核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)共同組成[4]。以該類病毒的裸基因組RNA直接轉染時，RNA在細胞內不能進行有效的轉錄和復制[5]。在NDV的復制過程，首先進行的是各種基因的轉錄。病毒RNA聚合酶以核衣殼化的(-)ssRNA(RNPs)為模板，先與基因組(-)ssRNA的3'端Leader序列中的單一進入位點結合，轉錄出一個短的Leader RNA；然后利用病毒基因組各基因兩端存在的各種轉錄起始及終止信號轉錄出各種病毒mRNA[6-7]。P和L蛋白均作為轉錄復合體的亞基組成，并在轉錄延伸、加poly(A)尾(大約5個～7個A)等方面發(fā)揮功能。該轉錄過程是在線性的基因組上，通過轉錄復合體的移動，并與位于基因組上的NP蛋白相互作用，按每一個基因的起始及終止位置不斷轉錄產生出各個基因的單一順反子，這些病毒mRNA再利用宿主細胞的翻譯系統(tǒng)翻譯出各種結構和非結構蛋白。

在各基因轉錄的發(fā)生后，病毒RNA聚合酶也利用基因組3'末端序列存在的復制信號啟動反義基因組(+)ssRNA的復制，(+)ssRNA再與NP、P和L蛋白結合形成RNPs結構，病毒RNA聚合酶以新合成的RNPs結構為模板啟動正義基因組(-)ssRNA的復制，然后(-)ssRNA與各種翻譯出的病毒蛋白裝配生成子代病毒粒子[10-11]。病毒蛋白的轉錄是從病毒基因組3'端第56個核苷酸開始的，而病毒基因組的復制則是從第1個核苷酸開始的[8]。

1 NP蛋白的結構與功能

ClassⅡ基因型Ⅰ-Ⅳ型和ClassⅠ基因型NDV的NP基因全長為1747 nt，ClassⅡ基因型Ⅴ-Ⅸ型NDV的NP基因全長為1753 nt，即在NP基因的非編碼區(qū)多出了6 nt，研究表明該6個堿基的出現(xiàn)與病毒的毒力沒有明顯關系，至于它的確切功能目前尚在研究之中。NP基因的1400位～1700位堿基的GC含量較高，有的甚至達到70%左右，而與Ⅰ-Ⅳ的毒株相比，Ⅴ-Ⅸ型NDV毒株所多出的6個堿基恰好位于該區(qū)域，至于6堿基的插入是否與該區(qū)域特殊的結構有關，還是與其它的一些致病機制有關，目前還沒有定論。

所有NDV NP蛋白基因編碼區(qū)長度均為1467 nt，編碼489個氨基酸殘基，NP蛋白mRNA的3'非編碼區(qū)在強弱毒株間表現(xiàn)出相當大的差異，但能否作為強弱毒判定的標準目前尚無定論。許多副粘病毒的NP蛋白在起始的多個氨基酸相當保守，這可能與病毒基因組RNA的結合有關[12]，而末端的125個氨基酸只有很低的同源性，推測該末端的氨基酸可能與病毒的RNA共同形成復制與轉錄的模板[13]。同多數副粘病毒一樣，NP蛋白合成后具有自動組裝的特性[14-15]，形成鯡魚骨狀的結構，研究表明N端1位～375位氨基酸與該結構的形成有關，而375位～439位氨基酸則決定了該結構的長度[16]。這種自動裝配功能可以被P蛋白抑制，P蛋白通過其氨基端與NP蛋白的羧基端結合，阻止NP蛋白的自動裝配，防止NP蛋白的“非法”衣殼化。從439位氨基酸到489位氨基酸的C端，是與RNA的結合區(qū)，蛋白帶有-7到-12個的凈電荷，是非保守的(約占20%)，這個區(qū)域是一個高變區(qū)和主要負電區(qū)。NDV NP蛋白的氨基末端的最遠端區(qū)域并不參與核殼的組裝，因此可能是NP的中間的堿性結構域與RNA相互作用[9]。

NP蛋白是NDV 6個結構蛋白之一。NP蛋白的形態(tài)學特征呈鯡魚骨樣結構[17]，呈易彎曲的螺旋狀結構，病毒基因組RNA被大約含有2500個～2600個NP蛋白亞單位纏繞。每個NP蛋白，直徑約18 nm，長約1 um，分子量為56 ku。NP是NDV核衣殼的主要的蛋白質部分，它和病毒基因組RNA結合，形成螺旋對稱的卷曲狀核衣殼。該NP結構相當緊密，通過高鹽或氯化銫梯度分析發(fā)現(xiàn)NP蛋白是唯一一種不能從核衣殼中去除的病毒多肽，這表明NP蛋白對于核衣殼組成至關重要，并與病毒基因組RNA緊密聯(lián)系，與病毒的增殖密切相關[18]。

NP蛋白上分布有3個活性區(qū)：(1)P蛋白結合區(qū)，NP蛋白通過該區(qū)活性，與P-L蛋白結合成為依賴RNA的RNA聚合酶亞基；(2)NP-NP相互結合位點，從而使病毒的RNP形成螺旋狀彎曲；(3)與病毒基因組的結合位點，NP蛋白通過非共價鍵形式，以準確包裹6個核苷酸的方式包裹基因組和基因組復制的中間體——正鏈RNA。

NDV基因組的3'端和5'端均有一段RNA序列作為衣殼化信號，NP蛋白對RNA的衣殼化依賴于RNA上的衣殼化信號，NP與含引導序列的RNA的結合能力比不含引導序列的RNA高達5倍～10倍。P蛋白通過和NP蛋白的相互作用，抑制NP蛋白對不含引導序列的RNA的結合，防止RNA非法衣殼化。

NP蛋白僅在細胞質中生成并聚集，并不像流感病毒的NP那樣，在細胞質中合成后還會進入細胞核，經修飾后再回到細胞質中。NP蛋白除具有衣殼化功能外，不具有任何酶的活性。NP蛋白還能通過與M蛋白的相互作用，在組裝病毒粒子時，準確地將病毒RNP包裝入病毒粒子中。由于M蛋白是堿性蛋白，擁有大量的堿性氨基酸，帶有大量的電荷，而NP蛋白則也帶有大量的電荷，因此雙方能通過電荷相互作用，從而使病毒的核酸物質包裝入病毒中。

與病毒表面的囊膜糖蛋白相比，NP與其它3個內部蛋白受免疫選擇壓力的影響要小[8]。NP蛋白也具有免疫顯性抗原決定簇，但目前的研究表明NP蛋白不具有免疫保護功能[19]。NP蛋白含有3個抗原區(qū)分別為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。其中Ⅰ和Ⅲ兩個抗原區(qū)相互重疊。NDV NP蛋白的抗原性同樣在逐漸發(fā)生變化，因此NDV蛋白的變化并不僅僅局限于囊膜糖蛋白，而是所有蛋白均在發(fā)生進化的。選擇壓力并不是蛋白抗原發(fā)生的主要原因，由于受選擇壓影響小的內部蛋白與囊膜糖蛋白相比，在進化過程中它們對應的基因變異的程度是同步的。從進化學角度看，畢竟，RNA病毒本身缺乏有效的轉錄和翻譯校對系統(tǒng)致使其抗原性易變，是其賴以生存的主要方式之一。

2 NP蛋白與病毒的基因組轉錄和復制

NDV的基因組為負鏈RNA，這意味著當它們在感染進入宿主細胞時，其基因組不能直接作為mRNA進行病毒相關蛋白的翻譯，首先需要以其負鏈RNA基因為模板的轉錄，以形成正鏈mRNA。NDV基因組遵循6堿基原則，所有NDV基因組長度均為6的倍數[20]，只有當NDV基因組RNA核苷酸的數量為6的倍數時，病毒的RNA才能有效進行復制轉錄，這種現(xiàn)象被稱為“6堿基原則”[21]。從基因組3'端到5'端，每6個堿基能被一個NP蛋白亞單位能準確地包裹，并以此方式依次對全部基因組RNA進行包裹。如果RNA鏈全長正好是6的倍數，殼體包裹持續(xù)到3'端時，則基因組RNA全部堿基恰好被NP蛋白亞單位全部覆蓋和包裹；如果基因組不符合6的倍數，則基因組不能被NP蛋白群包裹，以致所形成RNP沒有活性。因此，NP蛋白對病毒基因組RNA及反基因組RNA(病毒復制所必須的正鏈中間體RNA)的殼體包裹對病毒的復制非常重要[22]。從理論上講，每個ClassⅠNDV帶有2533個NP蛋白，而ClassⅡ基因型Ⅰ-Ⅳ型和ClassⅡ基因型Ⅴ-Ⅸ型NDV分別帶有2531和2532個NP蛋白。不管是病毒的基因組RNA復制的中間體正鏈RNA，還是復制的子代病毒基因組(負鏈)，NP蛋白均能迅速對其包裹，主要是防止細胞中的核酸酶對其降解。沒有NP蛋白包裹，這些RNA就沒有生物學活性，就不能轉錄或復制。

作為轉錄復合體的亞基組成元件，P-L蛋白與位于病毒基因組中的NP蛋白相互作用，通過轉錄復合體的移動，在線性的基因組上，按每一個基因的起始及終止位置不斷轉錄產生出各個基因的單一順子。從病毒基因組3'端到5'端的轉錄病毒基因過程中，在轉錄NP下游基因時，轉錄酶總是重新回到最初的NP轉錄起始點，再往下游方向作線性滑動轉錄，而每次轉錄則增加一個下游基因，如此往復運動。據此，筆者將其描述為“拉鏈模型”(Zip Modle)。

NDV的這種轉錄方式被稱為轉錄極性效應[23]，越靠近3'端的基因其轉錄產物越多，越靠近5'端轉錄產物的量越少，也就是說病毒基因轉錄和翻譯的水平是NP>P>M>F>HN>L。L蛋白的基因雖然占病毒全基因組總長度的一半，但它的轉錄和翻譯水平最低?？梢韵胂螅挥谧钕掠蔚腖蛋白由于是酶類，而作為生物化學催化劑，病毒的復制周期活動中所需要的量一定較少。

根據病毒復制的要求，NP蛋白與P蛋白一起，可能會作為病毒的立即早期蛋白被首先轉錄翻譯，因為這兩種病毒蛋白與病毒的基因轉錄、mRNA的轉移、病毒基因的復制密切相關，而其他結構蛋白(如F蛋白等)，或對mRNA轉錄有抑制作用的M蛋白，主要在感染晚期方能大量轉錄表達[24]。

在病毒的感染過程中首先需要進行的是轉錄產生mRNA，翻譯出最初必需的蛋白，之后才開始產生正鏈復制中間體RNA。NDV的NP基因RNA干擾試驗表明，可導致病毒產量和其他病毒結構蛋白mRNA轉錄水平的下降，表明了NP蛋白對于其他病毒組分轉錄翻譯乃至病毒復制的重要性。

當NP蛋白合成未達到一定數量時，以病毒基因組RNA為模板合成的正鏈RNA主要為轉錄產物mRNA；當翻譯的NP蛋白的量積累到足夠濃度時，它即可與基因組中的先導RNA序列編碼區(qū)內的順式作用元件結合，停止轉錄過程，啟動復制過程。因此，只有到轉錄翻譯進行到一定的時候，以能夠保證有效數量的NP蛋白組份用于復制時，子代病毒的RNA才能得以大量合成。從結構上分析，mRNA的形成和復制中間體正鏈RNA的形成都是在相同的依賴RNA的RNA聚合酶的作用下完成的，但前者在特定部位表現(xiàn)出一定的差異，如帽子結構m7GpppAm和poly(A)尾的形成；而后者則沒有這類與翻譯有關的結構，這就導致子代病毒RNA的復制必須有待于轉錄翻譯過程進行到一定的程度，即感染細胞內有足量的相關病毒蛋白(如NP蛋白等)才能進行[25]。

3 病毒蛋白對宿主細胞轉錄和翻譯的抑制作用

在NDV感染的早期，我們在體外常常觀察到一種現(xiàn)象：無論是何種宿主細胞，在病毒感染后，往往立即停止其生長，這就是所謂的“宿主細胞蛋白質合成關閉現(xiàn)象”。這種現(xiàn)象意味著：1.蛋白質合成關閉是細胞本身抵抗病毒入侵的一種自身防衛(wèi)反應，以停止蛋白質合成的方式來限制病毒的增殖，并和干擾素產生、細胞凋亡等非特異性抗病毒機制一起，形成細胞進化中所產生的天然保護應答；2.這種細胞蛋白合成的關閉也可能是病毒感染細胞過程中所產生的特定生物學效應，其目的是終止細胞自身蛋白質的合成，使其相應的系統(tǒng)轉而為病毒增殖服務。

在感染的最早期，L蛋白可能將宿主細胞mRNA上5'端帽子結構(10 nt～15 nt)切下來，作為病毒RNA基因轉錄的引物[34]，而宿主細胞的帽子結構又有一種優(yōu)先翻譯特點存在[35-36]。與大部分單股負鏈病毒相似，NDV基因組存在著從3'到5'轉錄效率由高到低的極性現(xiàn)象。推測，NP蛋白以及P蛋白可能被優(yōu)先轉錄，而NP和P蛋白的mRNA的5'端非翻譯區(qū)又可能存在著優(yōu)先選擇性翻譯結構，所以這兩種蛋白作為病毒轉錄復制的所必需的最初的立即早期蛋白而被大量翻譯[26]。

這個現(xiàn)象可能就是所謂的病毒mRNA的選擇性翻譯現(xiàn)象。從邏輯上可以理解，在病毒感染宿主細胞后，病毒mRNA和細胞mRNA之間勢必在利用有限的翻譯資源的過程中存在競爭，病毒mRNA必須具備較大的優(yōu)勢才能取代細胞mRNA，以完全獨享這一資源[28]。事實上，在感染初期，病毒mRNA在相對數量上并不占有優(yōu)勢，這就需要一種機制來優(yōu)先翻譯病毒蛋白，并抑制翻譯細胞蛋白。這種機制可能是：對細胞而言，表現(xiàn)為細胞蛋白合成抑制、細胞mRNA的帽子結構被病毒的L蛋白裁剪并被轉加到病毒mRNA上，細胞mRNA在核內被降解、細胞mRNA從核內向胞漿轉運過程的抑制、細胞內PKR酶系統(tǒng)的活性抑制等[27]。以流感病毒為例，這些現(xiàn)象在主要包括病毒蛋白NS1的抑制[29](在NDV可能是M蛋白行使了這一功能[30])和細胞P58IPK蛋白的抑制[31]；細胞mRNA翻譯起始和延伸階段的抑制；eIF4E的去磷酸化[32]，這些機制全面地抑制了細胞的翻譯過程。而對于病毒來說，表現(xiàn)有病毒mRNA帽子結構依賴的選擇性翻譯；病毒mRNA的天然優(yōu)先翻譯；病毒基因中的前導RNA序列，即Leader和Trailer序列能對宿主細胞轉錄的產生抑制，但必須得在M蛋白的參與下才能發(fā)揮作用；病毒mRNA 5'-UTR介導的優(yōu)先翻譯；細胞激酶MNK1被抑制，不能使帽子結構起始因子eIF4G磷酸化，進而影響到其與mRNA的結合，造成細胞蛋白合成受阻；eIF4G被用于病毒mRNA；病毒蛋白合成的臨時調節(jié)機制等。大量的研究資料表明，病毒成分還對宿主細胞RNA分子的加工及轉運過程具有抑制作用，如NP蛋白可以結合到宿主細胞的mRNA 3'端poly(A)結構上，使得mRNA滯留在細胞核內，不能轉運到細胞質中以進行下一步翻譯?？傊?，通過多種途徑，宿主細胞的轉錄和翻譯被抑制，從而保證了病毒翻譯效率的最大化[33]。

結束語

病毒感染是一類連鎖事件，這類連鎖事件中存在著密切聯(lián)系，表明了病毒在感染過程中一種全面調控的系統(tǒng)特點，病毒的結構蛋白的功能呈多樣化，特別是在感染早期出現(xiàn)的病毒內部結構蛋白。研究表明，作為立即早期蛋白，NP蛋白在病毒感染和復制的早期具有非常重要的功能，它與形成RNPs的其它兩個蛋白的以及與RNA的結合對于其功能發(fā)揮至關重要。我們認為，NP蛋白可以作為病毒治療的藥物靶標，針對NP蛋白的這些結合位點，進行相應的藥物設計應該是有相當的前景的。篩選出來的藥物小分子藥效實驗表明，能嚴重抑制病毒在細胞上的增殖。雖然目前對NP蛋白的研究相對清楚，但還需要對它的其它功能進行深入解析，特別是與M蛋白的相互作用還有待于進一步研究。

NP蛋白作為NDV中6個結構蛋白之一，竟有如此多而精妙的功能，這種系統(tǒng)性周密之于病毒如此簡單的生命組成，不能不使我們感嘆生命的精巧和進化的力量。

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