蔣小武

（西南大學(xué)榮昌校區(qū)，重慶 402460）

淺析氟喹諾酮類獸藥殘留檢測方法

蔣小武

（西南大學(xué)榮昌校區(qū)，重慶 402460）

解決獸藥殘留監(jiān)控問題是提高動物源性食品質(zhì)量，保障食品安全的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)之一，因此在食品檢驗(yàn)中建立一些方便快捷的檢測方法顯得尤為重要。本文以獸藥氟喹諾酮類為例，系統(tǒng)闡述了目前在臨床檢測中已經(jīng)建立的有關(guān)氟喹諾酮類藥物殘留的檢測技術(shù)，以期能為其他藥物殘留檢測提供參考方向。

氟喹諾酮類 藥物 殘留 檢測方法

1 引言

據(jù)2010～2011年度中國全面小康研究中心給出的《消費(fèi)者食品安全信心報告》結(jié)果顯示，近7成調(diào)查報告受訪者對食品“沒有安全感”[1]，食品安全在公民最擔(dān)心的5大安全問題中“獨(dú)占鰲頭”。民以食為天，食以安為先，食品安全問題因關(guān)系到人的健康和安全而受到各國政府和全社會的高度重視，已成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)，而農(nóng)藥、獸藥的濫用造成在食品中殘留量過高的問題十分突出，是影響食品安全的最重要的化學(xué)性因素之一。隨著養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，獸藥的使用范圍不斷擴(kuò)大，用量不斷增加。藥物的應(yīng)用在提高動物產(chǎn)品產(chǎn)量的同時，食品中造成了極為嚴(yán)重的獸藥殘留，特別是不遵守休藥期規(guī)定、超量使用或非法使用違禁藥物常常導(dǎo)致嚴(yán)重后果。獸藥殘留不僅危及人體健康，主要表現(xiàn)為變態(tài)反應(yīng)、細(xì)菌耐藥性、三致作用（致癌、致畸、致突變）等，還嚴(yán)重著影響我國動物性食品的出口，給畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)造成了極大的負(fù)面影響，由此造成的損失和損害已引起了公眾的普遍關(guān)注[2-3]，為此，建立一套完整的獸藥殘留檢測體系顯得十分必要。

2 氟喹諾酮類藥物概述

氟喹諾酮類（Fluoroquinolones，F(xiàn)Qs）藥物是喹諾酮類藥物的第3代產(chǎn)品，它代指一族人工合成的具有6-氟-4-喹諾酮環(huán)基結(jié)構(gòu)的廣譜殺菌性抗菌劑，對革蘭氏陽性菌和陰性菌、支原體、某些厭氧菌均有效，主要通過抑制細(xì)菌DNA螺旋酶作用，阻礙DNA合成而導(dǎo)致細(xì)菌死亡[4]。因其抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、與其他抗菌藥物無交叉耐藥性、毒副作用小，半衰期長、具有抗菌藥后效應(yīng)等特點(diǎn)而被廣泛用于動物和人類的多種感染性疾病的治療[5-6]。任何藥物都有副作用，氟喹諾酮類藥物也不例外[7]。隨著FQs在動物中的廣泛應(yīng)用，常常有不合理用藥和濫用藥情況發(fā)生，殘留在人和動物的糞便和尿液等排泄物中的藥物不斷進(jìn)入環(huán)境，在新的選擇壓力下，環(huán)境細(xì)菌的耐藥性越來越普遍[8]。由于FQs藥物的不良反應(yīng)主要發(fā)生在人類，動物則反應(yīng)不大，但動物用藥后的藥物殘留可以通過食物鏈傳播，同樣會引起人類不良反應(yīng)現(xiàn)象的發(fā)生[9]，除了其毒副作用等對人產(chǎn)生直接危害外，更為嚴(yán)重的是動物性食品中殘留較低濃度的藥物容易誘導(dǎo)人類致病菌產(chǎn)生耐藥性，使易感人群產(chǎn)生過敏反應(yīng)、激素障礙變態(tài)反應(yīng)等[10-11]，從而不利于該類藥物在人類疾病的治療。為此，對動物體內(nèi)FQs的殘留檢測已越來越引起了人們的廣泛關(guān)注。

3 氟喹諾酮類藥物殘留的檢測方法

目前，常用于氟喹諾酮類藥物殘留的檢測方法可分為4大類：微生物法、儀器分析法、化學(xué)發(fā)光與電化學(xué)發(fā)光分析法及免疫分析法。其中儀器分析法常見的有高效液相色譜法（HPLC）、液-質(zhì)聯(lián)用分析法（LC/MS）、高效毛細(xì)管電泳法（HPCE）等；免疫分析檢測法包括間接競爭Elisa測定法、免疫傳感器分析法、免疫親和色譜（IAC）分析法等[12]。

3.1 微生物法

微生物法是應(yīng)用最早而廣泛的方法，適用于對畜禽組織中的抗菌藥物進(jìn)行

快速篩選檢驗(yàn)。其測定原理是根據(jù)抗生素對微生物的生理機(jī)能、代謝的抑制作用來定性或定量地檢測確定樣品中抗生素的殘留[10]。該法雖然能檢測高濃度的藥物殘留，操作相對簡單，所需費(fèi)用成本低，能適用于大量樣品的快速篩選檢測[13]，但通常的檢測限高于樣品所規(guī)定的最大殘留限量[7][12]，而且靈敏度較低、特異性不強(qiáng)[14]，耗時較長。

據(jù)刑應(yīng)壽[15]等報道，環(huán)丙沙星在磷酸鹽緩沖液、肌肉、肝臟和腎臟中的最低檢測限分別為0.025 μg/ml、0.05 μg/g和0.075 μg/g，該方法靈敏度和回收率高，操作簡便，不需特殊設(shè)備，樣品用量少，易于推廣，適于環(huán)丙沙星的定量檢測；Okernman[16]等報道了利用改良的歐洲四平皿法檢測市售肉品中的恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留，但該法的檢測限高于歐盟所規(guī)定的MRL；陳曦[11]等以金葡菌為工作菌，發(fā)現(xiàn)利血平增敏法可使恩諾沙星最低檢測限由0.125μg/ml降低到0.0156μg/ml，提高了靈敏度；沈翠香[17]等通過微生物抑制法在培養(yǎng)基中添加適量已知濃度的恩諾沙星來提高敏感菌的敏感度，利用紅四氮唑顯色，檢測恩諾沙星的殘留，其檢測限從50 μg/kg降到10 μg/kg；鄭晶[18]等比較了用微生物法與酶聯(lián)免疫分析法檢測氟喹諾酮類藥物的殘留，結(jié)果顯示微生物法更適合這類藥物的檢測；胡鯤[19]等用微生物顯色法測定水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留最低檢測限可達(dá)50μg/kg，適合與生產(chǎn)、銷售、流通等非實(shí)驗(yàn)室條件下作為初篩方法使用。

3.2 儀器分析法

3.2.1 高效液相色譜法（HPLC） HPLC是在經(jīng)典的液相色譜法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，通過引入高分離效能的色譜柱和高靈敏度的紫外線檢測器或熒光檢測器，發(fā)展了氣相色譜的理論和技術(shù)，特別適用于高沸點(diǎn)、大分子、極性強(qiáng)和熱穩(wěn)定性差的化合物的分析。目前HPLC法廣泛應(yīng)用于檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)、科研單位、養(yǎng)殖加工企業(yè)[20]，殘留檢測多以此法為國家標(biāo)準(zhǔn)（GB），它具有氣相層析的全部優(yōu)點(diǎn)，分離能力強(qiáng)、靈敏度高、可在室溫下進(jìn)、應(yīng)用范圍極廣[7，13]，是目前最常用的檢測方法。

張鑫[21]等用緩沖鹽溶液提取，C18固相萃取小柱凈化，高效液相色譜-熒光檢測器同時檢測畜禽肉蛋及水產(chǎn)中4種FQs藥物，其中環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星定量限皆為10 ng/ g，達(dá)氟沙星定量限為2 ng/g，回收率在70%～93%之間；劉俊華[22]等同樣應(yīng)用此法檢測雞肉中四種氟喹諾酮類藥物殘留，結(jié)果氧氟沙星在0.003～0.6μg/g范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，而諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星在0.001～0.2μg/g范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，樣本平均加標(biāo)回收率在56%～105%之間；李丹[23]等對雞蛋中4種FQs藥物殘留量檢測，結(jié)果表明，4種氟喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星在2～500 ng/mL范圍內(nèi)峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，定量限均為10 μg/ kg，達(dá)氟沙星的定量限為2 μg/kg；孫煥[24]等運(yùn)用反相高效液相色譜法對豬肉組織中恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留量進(jìn)行檢測，結(jié)果環(huán)丙沙星、恩諾沙星的質(zhì)量濃度在2 g/L～100 g/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，它們的最低定量限均為2g/kg。

3.2.2 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS） 隨著研究的深入和對食品安全越來越高的重視，定性準(zhǔn)確，靈敏度更高的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)漸漸被人們采納，這種技術(shù)不僅可以更精確的進(jìn)行定量分析，避免了以往因?yàn)闄z測手段達(dá)不到國外要求而遭遇的貿(mào)易壁壘，而且可準(zhǔn)確定性，大大減少液相色譜法中出現(xiàn)的雜峰干擾現(xiàn)象，喹諾酮類藥物定量限可達(dá)到5 ng/mL，檢測限在1ng/mL[25]，靈敏度高，能方便地對微量獸藥殘留組分進(jìn)行檢測，是目前檢測食品中FQNs殘留確證檢測的最佳方法之一，但該方法的缺點(diǎn)是儀器較為昂貴[13]，目前還難以普及。

黃優(yōu)生[26]等則用用酸性乙腈提取魚肉中的4種氟喹諾酮藥物殘留，然后用正己烷脫脂，氮吹濃縮定容后，用反相液相色譜分離，以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，外標(biāo)法定量，結(jié)果4種FQs藥物的線性范圍為2～40μg/kg，檢出限為0.1～0.4μg/kg，定量限為0.3～1.0μg/kg；Schneider[27]等利用LC-MS法檢測雞肝臟和肌肉組織中8種FQs類藥物的殘留，該方法的檢測限（肝臟/肌肉ng/g）分別為：脫乙烯環(huán)丙沙星（0.3/0.1），諾氟沙星（1.2/0.2），環(huán)丙沙星（2.0/1.5）、達(dá)氟沙星為（0.2/0.1）、恩諾沙星（0.3/0.2），奧比沙星（1.5/0.5）、沙拉沙星（2.0/0.6）和二氟沙星（0.3/0.2），回收率為60%～93%；武艷如[28]等測定牛肉中3種氟喹諾酮藥物（環(huán)丙沙星、恩諾沙星和沙拉沙星）殘留，發(fā)現(xiàn)在1～20 pg/μL范圍內(nèi)3種FQs藥物的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.992，檢出限為8～19μg/kg，回收率75.2%～96.3%；孫雷[29]等對豬肉組織中7種氟喹諾酮類藥物（氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、達(dá)氟沙星、二氟沙星和沙拉沙星）殘留檢測顯示了7種FQs藥物在5-250ng/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，方法檢測限為5ng/g，定量限10ng/g，平均回收率為80.7%～116%。

3.2.3 高效毛細(xì)管電泳法（HPCE） 高效毛細(xì)管電泳法是近年發(fā)展起來的新技術(shù)，與常用的HPLC法相比，它不受運(yùn)行緩沖液的酸、堿性和其中的表面活性劑等添加劑的影響，具有樣品用量少、分析速度快、分離效率高、運(yùn)行成本低、適用范圍廣等特點(diǎn)[7]，有利于實(shí)際樣品的分析，也是一種常用的藥物殘留檢測手段。近年來，隨著前處理技術(shù)的進(jìn)步以及方法自身的改善，現(xiàn)在此法已經(jīng)可以對某些藥物進(jìn)行檢測[20]。

李慧[30]等以毛細(xì)管電泳建立了同時檢測雛雞、哺乳豬等飼料中5種氟喹諾酮類藥物的方法，在274 nm處，分離電壓為18 kV，分離溫度為22 ℃，在80 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉pH為6.5的運(yùn)行緩沖液下，5種藥物可在10 min內(nèi)完全分離，方法的平均回收率為84.42%～107.5%，精密度為1.36%～1.69%，回收率和精密度能夠滿足對這5種藥物的檢測要求；Hernandez[31]等應(yīng)用毛細(xì)管等速電泳-毛細(xì)管區(qū)帶電泳檢技術(shù)測豬血清中的環(huán)丙沙星、恩諾沙星和氟甲喹，其檢出限分別為70、85和50 μg/L，該方法簡單靈敏，可作為HPLC的一種替代方法；劉娜[32]等用HPCE法測定復(fù)方乳酸環(huán)丙沙星注射液中環(huán)丙沙星和利巴韋林，結(jié)果它們的的校準(zhǔn)曲線在5 mg/L～100 mg/L內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，復(fù)方乳酸環(huán)丙沙星回收率97.2%～110%；Barron[33]等結(jié)合固相萃取技術(shù)，進(jìn)行雞肉中雙氟沙星和沙拉沙星的檢測，定量限分別可達(dá)到25ng/mL、50ng/ml。

3.3 化學(xué)發(fā)光與電化學(xué)發(fā)光分析法

化學(xué)發(fā)光分析法（CL）是借助反應(yīng)物或生成物吸收化學(xué)反應(yīng)釋放的化學(xué)能由基態(tài)躍遷至電子激發(fā)態(tài)，再由電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級返回基態(tài)時所產(chǎn)生的光輻射來進(jìn)行分析的方法。該法反應(yīng)裝置簡單，不需要復(fù)雜昂貴的分光系統(tǒng)，檢測靈敏度高、光學(xué)系統(tǒng)簡單、信號背景低、可與高效分離方法聯(lián)用，同時滿足了分析的靈敏度和選擇性要求，有利于復(fù)雜樣品的定性定量分析，目前它已廣泛用于不同藥物的分析研究[34-35]。常見的CL有敏化化學(xué)發(fā)光法、紫外分光光度法和熒光法等。如賈麗華[36]等研究了恩諾沙星在膠束體系中的熒光特性，發(fā)現(xiàn)十二烷基硫酸鈉對恩諾沙星有較強(qiáng)的增敏作用，由此建立了膠束增敏熒光光譜法測定恩諾沙星線性范圍為0～0.64μg/mL，檢出限為4.75 ng/mL；孫漢文[37]等建立了流動注射化學(xué)發(fā)光檢測恩諾沙星，結(jié)果顯示在3×10-7～3×10-6g/mL范圍內(nèi)，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與恩諾沙星的濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢出限為1.1×10-7g/mL；周華[38]等則運(yùn)用環(huán)丙沙星對NaOH介質(zhì)中的魯米諾-鐵氰化鉀的化學(xué)發(fā)光具有較強(qiáng)的增敏作用而建立起環(huán)丙沙星藥物的流動注射化學(xué)發(fā)光法且測得其檢出限1.2×10-6g/L；陳玉海[39]等建立了溴甲酚綠萃取分光光度法測定恩諾沙星在0.25～4.0mg/L范圍內(nèi)服從比耳定律，方法檢出限為49.2μg/L。

電化學(xué)發(fā)光（ECL）分析法是將化學(xué)發(fā)光分析法與電化學(xué)手段相結(jié)合的一種新的分析技術(shù)。它具備化學(xué)發(fā)光的高靈敏度、寬線性范圍、儀器簡單、重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)外，還有效克服了化學(xué)發(fā)光選擇性差的缺點(diǎn)，具有靈敏度高、選擇性好、操作簡便、易于控制、并且實(shí)驗(yàn)中的一些試劑可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，是近年來分析技術(shù)中一種重要的檢測手段，受到了人們的特別關(guān)注[34]。常見的ECL有膠束電動毛細(xì)管電泳法、示波極譜法和吸附溶出伏安法等。如孟勇[40]等應(yīng)用反相高效液相色譜法配二極管陣列檢測器，建立并測定中華絨螯蟹肝臟中諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星殘留量的方法，結(jié)果表明，該方法線性關(guān)系和重復(fù)性良好，樣品中3種FQs藥物殘留的回收率在73.26%～85.82%，最低檢測限為10μg/kg。

3.4 免疫分析法

免疫分析技術(shù)是以抗原-抗體的特異性、可逆性結(jié)合為基礎(chǔ)的新型分析技術(shù)[6]。其原理是使用特定的抗體（由于獸藥的分子量都小于5000，是半抗原，需與大分子物質(zhì)如HAS、BSA和KLH等載體聯(lián)接，形成免疫原，以此來制備針對單一藥物的高特異性抗體或針對某一類藥物的抗體）識別目標(biāo)藥物，目標(biāo)藥物和標(biāo)記藥物互相競爭性地與特異性抗體進(jìn)行結(jié)合，形成藥物抗體復(fù)合物，通過復(fù)合物和酶結(jié)合顯示的顏色或底物的顏色來進(jìn)行分析[41-42]。依據(jù)標(biāo)記物的不同可將免疫測定法分為酶標(biāo)記法、熒光標(biāo)記法、膠體金標(biāo)記法等。

由于免疫分析法不僅具有特異性高，準(zhǔn)確性好、方法簡單、靈敏度高，還可用于大批量樣品的快速檢測等特點(diǎn)[14]，因此它的發(fā)展非?？?，在食品安全檢測中的研究和應(yīng)用越來越多。如Duan[43]等用碳二亞胺法制備了環(huán)丙沙星的多克隆抗體，建立了環(huán)丙沙星的間接競爭ELISA法，結(jié)果檢測限為0.32 ng/ml，環(huán)丙沙星在豬肉、雞肉及牛乳中回收率分別為75.58%、81.20%和84.50%；趙銀麗[44]等采用混合酸酐法將恩諾沙星分別與BSA和卵清白蛋白偶聯(lián)制備免疫抗原和包被抗原，將免疫原免疫家兔，制備多克隆抗體，再應(yīng)用其研制恩諾沙星殘留阻斷ELISA快速檢測法，結(jié)果阻斷ELISA的線性檢測范圍為1～205ng/mL，靈敏度為1ng/mL，雞肉樣的平均添加回收率分別為87.35%；魏東[45]等以沙拉沙星為半抗原，BSA偶聯(lián)后免疫兔，獲得對多種氟喹酮類藥物（諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星）有特異性的廣譜性抗體，并以沙拉沙星與卵清白蛋白的偶聯(lián)物作為包被原，建立優(yōu)化了間接競爭ELISA檢測方法，結(jié)果沙拉沙星最低檢出限為19.319μg/L，諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星最低檢測限分別是22.646、26.181和19.054μg/L；陳雪嵐[46]等采用丙基碳化二亞胺鹽酸-NHS法制備恩諾沙星-BSA免疫原和恩諾沙星-OVA檢測抗原，并建立了間接競爭ELISA法測得恩諾沙星殘留檢測限為1 ng/mL，線性范圍在1～100ng/mL之間；Mellgren[47]等研制了能檢測牛乳汁中恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物的表面等離子共振免疫傳感器，該方法的恩諾沙星檢測限為1.5 ng/ml。

4 前景展望

目前國內(nèi)對氟喹諾酮類藥物殘留的檢測主要還是單物質(zhì)的檢測，也有少數(shù)針對多物質(zhì)殘留的檢測[7]。微生物法適用于殘留量明顯的藥物快速篩選；色譜儀器法雖具有高效、快速、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，但樣品前處理比較繁瑣，所需儀器也比較昂貴，不適合大量樣品的快速檢測；免疫分析將最有可能取代色譜儀器分析成為此類藥物最常用的方法[12，41]，另外將各種分析技術(shù)聯(lián)用，可以使各種分析技術(shù)取長補(bǔ)短，獲得單一分析技術(shù)難以達(dá)到的效果，這將會成為以后殘留檢測的一個發(fā)展方向。

目前，我國獸藥應(yīng)用十分廣泛，雖然獸藥殘留量很低，但對人體健康的潛在危害卻相當(dāng)嚴(yán)重[3，48]。因此，完善獸藥殘留的檢測方法，特別是快速篩選和確認(rèn)的方法，加大篩選獸藥殘留的立法和方法標(biāo)準(zhǔn)化等方面的國際交流與合作，使我國的獸藥殘留監(jiān)控與國際接軌，對于促進(jìn)我國畜牧業(yè)的發(fā)展，保障食品安全，維護(hù)國民體質(zhì)與健康具有重要意義。

（略）

[1] 歐陽海燕.2010-2011年消費(fèi)者食品安全信心報告[J].小康，2011（1）

[2] 齊伶俐，井玉香，馬 林，等.動物產(chǎn)品獸藥殘留產(chǎn)生的原因及防控措施[J].中國食物與營養(yǎng)，2006（11）：17～18

[3] 張彥明，佘銳萍.動物性食品衛(wèi)生學(xué)書[M].第四版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2009

[4] 陳杖榴.獸醫(yī)藥理書[M].第三版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2009