姚 敏 陳 維 (吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春 130033)

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell，NSC)是具有多種分化潛能的神經(jīng)前體細(xì)胞，NSC移植技術(shù)對治療多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有著廣泛的前景。近年來，國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)除調(diào)控紅系祖細(xì)胞增殖、分化及成熟外，還與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生長、發(fā)育密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)旨在研究低氧環(huán)境下，EPO對NSC缺氧性損傷的保護(hù)作用，為NSC移植技術(shù)最終應(yīng)用于臨床提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco公司)、胎牛血清(FBS，杭州四季青生物技術(shù)有限公司)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF，Pepro Tech公司)、表皮細(xì)胞生長因子(EGF，Sigma公司)、EPO(武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司)，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)及二甲基亞砜 (DMSO，Sigma)，Anti-Nestin兔抗多克隆抗體及Anti-EPO兔抗多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 NSC分離培養(yǎng)及單細(xì)胞克隆的制作 實(shí)驗(yàn)大鼠均為吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，37℃環(huán)境中，無菌條件下取出孕齡11.5天大鼠的胎鼠腦組織剪碎，加入0.25%胰蛋白酶消化10 min，過濾采用120目銅網(wǎng)，去除組織纖維，加入濃度為20 ng/ml的EGF以及20 ng/ml的bFGF組成的生長培養(yǎng)基，離心后去除上清液以獲取單個細(xì)胞懸液，活細(xì)胞密度調(diào)整至1.0×105/ml，接種于培養(yǎng)瓶中，第1次換液于24 h，以后每2日換液1次，培養(yǎng)5～6 d，克隆形成后制成單細(xì)胞懸液，以細(xì)胞密度為1.0×105/ml進(jìn)行傳代，以此方法傳代3次即傳至P3，P3代液體離心后取NSC。

1.2.2 NSC的鑒定 選用P3代單細(xì)胞克隆球進(jìn)行Nestin免疫細(xì)胞化學(xué)染色，結(jié)果顯示Nestin表達(dá)呈陽性，神經(jīng)細(xì)胞球內(nèi)細(xì)胞質(zhì)均呈棕褐色;誘導(dǎo)分化后分別進(jìn)行神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)及膠質(zhì)纖維醇性蛋白(GFAP)免疫細(xì)胞化學(xué)染色，NSE表達(dá)陽性。GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)染色見細(xì)胞質(zhì)及突起呈棕褐色，胞體較大、突起粗而短。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)方法 在三氣培養(yǎng)箱中，實(shí)驗(yàn)環(huán)境分別設(shè)置為常氧環(huán)境及低氧環(huán)境，溫度均為37℃，培養(yǎng)120 h。通過調(diào)節(jié)N2濃度而設(shè)定O2的濃度為5%，選用P3代克隆干細(xì)胞單細(xì)胞懸液，實(shí)驗(yàn)組將NSC接種于含 EPO的濃度為50 U/ml的培養(yǎng)基中，同時設(shè)含等量的NSC且不含EPO的對照組。每日觀察NSC的分化情況。

1.2.4 檢測方法

1.2.4.1 MTT法檢測 以每孔約1.0×104個細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中，100 μl/孔。于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞貼壁后棄上清液。取10 μl溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)的MTT(5 mg/ml)加入每孔，然后在37℃孵箱中孵育4 h，將孔內(nèi)溶液棄掉，加入DMSO每孔100 μl，輕輕震蕩10 min以終止反應(yīng)并充分溶解甲臜顆粒。用酶標(biāo)儀570 nm處測吸光度(OD)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次實(shí)驗(yàn)中相同條件設(shè)6個平行孔。

1.2.4.2 免疫熒光染色及計(jì)數(shù) 將干預(yù)后的細(xì)胞分別接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔接種50個神經(jīng)球，常規(guī)處理后，分別做NSE、GFAP免疫熒光染色，倒置熒光顯微鏡普通光路及488 nm波長光路下計(jì)數(shù)每個視野下的細(xì)胞總數(shù)和陽性細(xì)胞數(shù)，求出陽性細(xì)胞數(shù)的百分率，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS10.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)資料以±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

各組細(xì)胞經(jīng)過5 d培養(yǎng)，常氧組、對照組、實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞克隆形成率(%)分別為 30.37±4.34、42.82±5.25、70.14±5.52，實(shí)驗(yàn)組明顯高于對照組(P＜0.01)。常氧組、對照組、實(shí)驗(yàn)組的 NSC的分化比率(%)分別為32.5±4.2、47.2±5.1、72.8±5.8，對照組與實(shí)驗(yàn)組比較有顯著性差異(P＜0.05)。

3 討論

EPO 是一種含唾液酸的酸性熱穩(wěn)定糖蛋白，近年來國內(nèi)外學(xué)者研究表明EPO及其受體廣泛存在于人和動物體內(nèi)多種組織和器官中。EPO與神經(jīng)系統(tǒng)的生長、發(fā)育密切相關(guān)，尤其是對發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用，并可提高神經(jīng)的再生與修復(fù)〔1〕。EPO可促進(jìn)腦組織在缺氧狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化，因而可改善缺血部位的供血及營養(yǎng)的供應(yīng)，NSC與缺氧的程度成正比，缺氧劑量越高，凋亡細(xì)胞的數(shù)量越多〔2〕。EPO還可作為神經(jīng)分化因子，影響神經(jīng)細(xì)胞的分化及再生，并可促進(jìn)NSC分化為多巴胺能神經(jīng)〔3〕。本研究取鼠胚腦源性神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行傳代克隆，在低氧環(huán)境中分別設(shè)立實(shí)驗(yàn)組及對照組，實(shí)驗(yàn)組接種于含EPO的培養(yǎng)基中，對照組與實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞克隆形成率(%)分別為42.82±5.25、70.14±5.52，實(shí)驗(yàn)組明顯高于對照組(P＜0.01)，表明EPO對低氧環(huán)境中的NSC有促進(jìn)分化及抑制凋亡的作用。國內(nèi)學(xué)者趙保明等〔4〕的實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持了本結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)的分化培養(yǎng)中，實(shí)驗(yàn)組顯示神經(jīng)球貼壁較快，周圍伸出突起早，培養(yǎng)24 h左右觀察到細(xì)胞從神經(jīng)球中遷出，2 d后見突起互相交織，3 d后即形成密集的網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)。P3代神經(jīng)球Nestin實(shí)驗(yàn)呈陽性反應(yīng)，誘導(dǎo)分化后部分神經(jīng)干細(xì)胞NSE實(shí)驗(yàn)陽性，部分GFAP實(shí)驗(yàn)陽性，說明培養(yǎng)出來的NSC有分化為神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞的能力。經(jīng)免疫熒光染色及計(jì)數(shù)方法測得實(shí)驗(yàn)組中的 NSE陽性細(xì)胞數(shù)最多，高于常氧組及對照組(P＜0.05)。EPO直接作用于大鼠的鼠胚內(nèi)皮細(xì)胞，使其分泌腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，該物質(zhì)可以促進(jìn)NSC的增殖和分化〔5〕。EPO與EPO受體結(jié)合后，改變后者的構(gòu)象，激活了蛋白酪氨酸激酶，使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化，啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而控制 NSC的增殖和分化，抑制其凋亡〔6，7〕。實(shí)驗(yàn)中的bFGF和EGF作為重要的有絲分裂原，在機(jī)體細(xì)胞的生長、發(fā)育以及受損組織的修復(fù)過程中起到重要的作用，二者對培養(yǎng)基中的NSC的生長具有很強(qiáng)的促進(jìn)作用。Eisen等〔8〕認(rèn)為，EPO不僅對NSC的缺氧性損傷有保護(hù)作用，對于其他形式的傷害同樣也具有保護(hù)作用。

總之，EPO作為新的神經(jīng)營養(yǎng)因子，對缺氧的胚鼠腦源性NSC有營養(yǎng)和保護(hù)作用，刺激神經(jīng)祖細(xì)胞的分化及增殖，阻止其凋亡，為EPO治療人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和退行性變提供了新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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6 Chang YC，Huang CC.Perinatal brain injury and regulation of transcription〔J〕.Curr Opin Neurol，2006;19:141-7.

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