馬芹穎 強 靜 王銘維 (河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 05003)

快速老化小鼠(SAMP8)是由日本京都大學竹田俊男教授開發(fā)，以學習記憶功能呈增齡性加速衰退為主要特征，自從1986年Miyamoto等人首次報道了SAMP8小鼠的這一基本特征，之后成為了研究老化和學習記憶障礙的理想哺乳動物模型之一，為了闡明其中的神經(jīng)生理學機制，人們進行了大量的研究。本文主要對SAMP8小鼠老化過程中神經(jīng)病理學的研究進行了綜述。

1 β淀粉樣蛋白

β淀粉樣蛋白(Aβ)是淀粉樣前體蛋白(APP)的主要代謝產(chǎn)物，Aβ是AD病人腦內(nèi)老年斑的主要成分，由39～42個氨基酸組成，分子量4.0 kD，三維結(jié)構(gòu)呈β型折疊，具有強自聚性，極易形成難溶的沉淀，主要分為Aβ40和 Aβ42兩種形式，Aβ42相對于Aβ40更易形成纖維，并早期選擇性沉積于阿爾茨海默病(AD)腦中，可損害腦內(nèi)與智力有關(guān)的特定結(jié)構(gòu)。所以β淀粉樣蛋白在腦內(nèi)的異常沉積是AD發(fā)生的主要機制之一。

β淀粉樣蛋白沉積在SAMP8小鼠腦內(nèi)與人類AD的變化相似，但并不是完全相同的，這一變化最早由Takemura等人報道，由抗血清合成人的β/A41-24或β/A41-15肽段染色發(fā)現(xiàn)β/A4樣免疫陽性顆粒結(jié)構(gòu)(β-LIGS)。這些結(jié)構(gòu)在不同腦區(qū)都能夠發(fā)現(xiàn)包括中隔、大腦皮質(zhì)、海馬、小腦、某些顱神經(jīng)核和神經(jīng)根，并且隨著年齡增長而數(shù)目不斷增加。但這些團粒結(jié)構(gòu)并不能被剛果紅或者硫(代)黃素s染色顯現(xiàn)。在Western印跡檢測中，主要的陽性條帶在14～18 kD之間，并且染色強度隨年齡增長而增加。β-LIGS被認為不僅是小鼠老化的新的形態(tài)學證據(jù)，而且還是理解淀粉樣蛋白沉積的合適線索。Fukunari等證實利用多克隆兔抗Aβ1-16進行組織化學染色能更早期的觀察到β-LIGS。在SAMP8小鼠腦內(nèi)β淀粉樣蛋白免疫陽性區(qū)域與proryl endopeptidase-like免疫陽性區(qū)域相似提示二者的共區(qū)域化現(xiàn)象。Kumar〔1〕等報道利用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)證實了4～12個月齡的SAMP8小鼠海馬Aβ水平隨年齡增加而增高。此外與Kumar在同一研究團隊Morley等人〔2〕也描述了在21個月齡的SAMP8小鼠海馬用小鼠抗人的Aβ抗體作為一抗進行免疫組化染色，可以觀察到Aβ斑塊。然而，在SAMP8小鼠腦內(nèi)用剛果紅或者硫(代)黃素S不能發(fā)現(xiàn)AD的標志老年斑樣結(jié)構(gòu)。最近，Jaume等人通過更為詳細的研究進一步明確了從6個月開始，SAMP8小鼠海馬內(nèi)即有Aβ沉積，其數(shù)量和程度隨年齡增加而逐漸增加，其沉積成分包括 Aβ40、Aβ42以及 APP〔3〕。

另外，免疫印記分析表明，淀粉樣前體蛋白APP樣蛋白在SAMP8小鼠也隨增齡而增加，并且與膠質(zhì)增生和GFAP表達增加有關(guān)。Morley等人報道SAMP8小鼠海馬內(nèi)有年齡相關(guān)的APP蛋白和RNA水平增高〔2〕。然而，在一項利用免疫細胞化學的研究中，在16個月的SAMP8小鼠海馬內(nèi)可以檢測到Aβ斑塊，但沒有發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元的減少和凋亡。同樣在APP轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)也沒有觀察到神經(jīng)元的減少〔4〕。這就提示，在SAMP8小鼠腦內(nèi)可能存在著抗凋亡因素或者在AD發(fā)生時是其他病理因素引起了細胞凋亡而并非Aβ〔4〕。

由于多項研究均顯示在SAMP8小鼠腦內(nèi)有Aβ沉積，并且觀察到隨增齡逐漸增多，并認為與其認知功能下降有關(guān)，為了進一步證實這一觀點，研究者們開始嘗試給予SAMP8小鼠抗Aβ處理，并觀察其認知功能。當SAMP8小鼠給予腦室內(nèi)注射抗Aβ的反義寡核苷酸以后，在杏仁體、中隔以及海馬的APP蛋白水平下降，蛋白質(zhì)氧化以及脂質(zhì)過氧化減低，并且可以觀察到學習和記憶的下降有所改善〔5，6〕。并且抗Aβ抗體還可以通過靜脈注射達到腦內(nèi)發(fā)揮上述作用，但用量要比直接腦內(nèi)注射大〔7〕。此外，在APP轉(zhuǎn)基因以及SAMP8小鼠體內(nèi)應(yīng)用抗Aβ抗體的免疫療法也可以導致Aβ沉積數(shù)量減少并可以逆轉(zhuǎn)學習和記憶障礙〔7，8〕。

關(guān)于抗Aβ抗體的免疫療效的機制也進行了探討，F(xiàn)arr等觀察到抗APP抗體可以增加老齡SAMP8小鼠海馬的乙酰膽堿水平，所以膽堿能通路可能是其發(fā)揮作用的機制之一〔9〕。另外還有研究者認為抗APP蛋白Abeta區(qū)域的反義核苷酸以及抗Aβ抗體的治療作用與減少老齡SAMP8小鼠腦內(nèi)的氧化應(yīng)激有關(guān)，可以減少腦內(nèi)蛋白的氧化，降低氧化標志物的水平〔6，10〕。最近，Ali等給予SAMP8小鼠抗Aβ抗體或APP反義核苷酸治療可以減少腦內(nèi)Aβ沉積，改善認知功能，減少氧化應(yīng)激。還發(fā)現(xiàn)這些治療可以進一步提高老齡SAMP8小鼠一氧化碳合酶(NOS)的活性，提高誘導型NOS(iNOS)的mRNA水平，降低神經(jīng)元內(nèi)NOS mRNA和蛋白水平，但是并沒有影響內(nèi)皮型NOS(eNOS)或者iNOS的蛋白的水平，以及eNOS的mRNA水平，這就提示在SAMP8腦內(nèi)Aβ和NOS之間有著復雜的關(guān)系，很可能是通過翻譯后調(diào)節(jié)機制進行的〔11〕。

2 神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFTs)和Tau蛋白的磷酸化

NFT也是AD的主要病理學特征之一，是導致神經(jīng)元纖維退化的主要原因，可作為大腦早老化的標志，AD患者較正常老人腦內(nèi)NFT數(shù)量更多、分布遍及整個大腦。在不同神經(jīng)元中NFT有不同形態(tài)。NFT隨AD的發(fā)展而增多，并與臨床癡呆程度相關(guān)。NFT主要由雙股螺旋細絲(PHFs)組成，而PHF的主要成分是高度磷酸化的tau蛋白。正常的tau蛋白是一種親水性、可溶性、非折疊的微管相關(guān)蛋白，主要分布于成熟神經(jīng)元的軸突，具有穩(wěn)定神經(jīng)元微管的作用，在維持神經(jīng)元生長、保持神經(jīng)元極性及胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運等方面起著重要的作用。

Canudas等報道5個月齡的SAMP8小鼠與同齡的SAMR1相比在皮質(zhì)、紋狀體、海馬有Tau蛋白的高度磷酸化〔12〕。并且在SAMP8小鼠腦內(nèi)也發(fā)現(xiàn)有α-突觸核蛋白的表達水平增高〔13〕。α-突觸核蛋白是在Tau蛋白高度磷酸化的過程中的一個強有力的誘導物質(zhì)〔13，14〕。氧化應(yīng)激被認為與α-突觸核蛋白的濃度有直接關(guān)系〔15〕。由于SAMP8小鼠體內(nèi)的抗氧化物酶的弱活性以及氧化狀態(tài)的的高活性，異常Tau蛋白的磷酸化和α-突觸核蛋白水平的提高可能部分是由于ROS的產(chǎn)生引起的〔13〕。另外與tau蛋白磷酸化的激酶也是研究的熱點之一，糖原合成激酶-3β(GSK-3β)和周期素依賴性蛋白激酶5(Cdk-5)是Tau蛋白磷酸化過程中的關(guān)鍵酶，有研究者報道在老齡SAMP8小鼠腦內(nèi)有Cdk-5水平增高，但GSK-3β水平?jīng)]有相應(yīng)增加〔12〕。Tajes等報道給予SAMP8小鼠鋰劑在體內(nèi)和體外均可減少細胞凋亡，并且減少Tau蛋白磷酸化過程中GSK-3β和CDK-5的水平，并且減少Tau蛋白在Ser199、Ser212和 Ser396位點的磷酸化〔16〕。Caballero等長期給予SAMP8小鼠飲水中加入褪黑素可以通過降低氧化應(yīng)激水平而部分逆轉(zhuǎn)Tau蛋白在Ser392位點磷酸化增加，減少 NFTs，降低 α-突觸核蛋白表達〔17〕。

3 PGSs-PAS(過碘酸-希夫)陽性團塊狀結(jié)構(gòu)

過碘酸-希夫(PAS)染色陽性的異常團粒狀結(jié)構(gòu)(PGSs)也在SAMP8小鼠腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)，與以上的病理變化相比，被認為是SAMP8小鼠特有的。PGSs的結(jié)構(gòu)微小，呈圓形到卵圓形的均一質(zhì)地，直徑達到5 μm，經(jīng)常聚集成群，與神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(GFAP)陽性的星形膠質(zhì)細胞的突起位置很近。能觀察到PGSs的腦區(qū)有海馬、梨狀皮質(zhì)、嗅結(jié)節(jié)、斜方體的神經(jīng)核以及小腦皮質(zhì)。SAMP8小鼠海馬內(nèi)PGSs聚集體數(shù)量的定量分析發(fā)現(xiàn)其在3個月齡開始出現(xiàn)，6個月齡以后數(shù)目急劇增加。相反地是PGSs聚集體在對照的SAMR1小鼠老齡才會出現(xiàn)。年齡相關(guān)的顆粒聚集形成的聚集體在C57BL/6小鼠腦內(nèi)也有報道，并且這些沉積物PAS染色呈陽性。類似的結(jié)構(gòu)被認為在C57BL/6小鼠腦內(nèi)也存在。用單克隆抗體進行免疫組化分析顯示這些沉著物對硫肝蛋白糖抗體免疫反應(yīng)陽性。然而，目前還不清楚在SAMP8小鼠腦內(nèi)PGSs是否存在于神經(jīng)元或者星形細胞的突起。

4 海綿體變性

海綿樣變性首先由Yagi等人報道，是SAMP8小鼠腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)的最早的形態(tài)學變化之一。SAMP8小鼠腦內(nèi)腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的神經(jīng)纖維內(nèi)可以看到大小不等的空泡，而在發(fā)育過程中在SAMR1腦內(nèi)則沒有明顯的空泡。退行性變發(fā)生在下丘腦到脊髓之間的水平，尤其是大細胞網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(MGRF)，橋腦網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，巨細胞網(wǎng)狀神經(jīng)核?？张菰?月齡開始出現(xiàn)，雖然隨著年齡增長星形膠質(zhì)細胞不斷增生，在4～8月齡不論是數(shù)量還是體積都達到高峰。從超微結(jié)構(gòu)上空泡可以分為2種形態(tài)。一種空泡在突觸后成分內(nèi)可以看到，在1月齡時樹突內(nèi)輕微膨脹，緊接著突觸后結(jié)構(gòu)中度膨脹，到2個月齡時樹突內(nèi)膜性結(jié)構(gòu)擴大。在5月齡時可觀察到髓鞘樣膜薄片緊包在大空泡周圍限制其擴大。另一種類型的空泡是因為在少突膠質(zhì)細胞主要密集的區(qū)域髓鞘破裂而出現(xiàn)的。這一改變在2月齡開始出現(xiàn)，在5月齡很明顯?？张莼亩糠治鲲@示在MGRF空泡的面積和數(shù)量隨年齡而增加，并且受到學習和記憶損害程度的影響。所以在被動回避反應(yīng)中學習記憶能力隨著在MGRF空泡化面積的擴大而不斷惡化，并且提出假設(shè)MGRF(尤其是中部背側(cè))具有與學習記憶相關(guān)的功能。為了證實這一觀點，對MGRF區(qū)域損傷的SAMR1小鼠進行了行為和記憶的測試。MGRF區(qū)域損傷的SAMR1小鼠與假手術(shù)組相比感覺閾值或者空曠地域活動沒有差別，但被動回避行為嚴重退化并且有效回避能力受損。MGRF有與學習記憶相關(guān)的功能，并且是腦內(nèi)學習記憶系統(tǒng)的一部分。網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的作用普遍認為是調(diào)節(jié)學習記憶過程以及保持清醒、注意力以及睡眠，所以可以假設(shè)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)損傷和學習記憶缺陷之間有病理生理關(guān)系。MHC-Ⅱ型陽性激活的小膠質(zhì)細胞的增殖和聚集體形成在腦干的海綿樣變區(qū)域也能觀察到。這些激活的小膠質(zhì)細胞在1或者2月齡開始出現(xiàn)，聚集體形成隨著增齡逐漸加重。

5 其他

另外，SAMP8小鼠黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元以及藍斑的去甲腎上腺素能神經(jīng)元在老化過程中較SAMR1小鼠退行性變化更快，數(shù)量減少，免疫電鏡下可以觀察到SAMP8小鼠黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元線粒體腫脹、細胞核內(nèi)陷，在紋狀體的多巴胺能纖維內(nèi)可以觀察到降解空泡的聚集。

6 結(jié)論

綜上，SAMP8小鼠腦內(nèi)的神經(jīng)病理學變化能夠較好地模擬AD以及老化腦的病理變化，但又不是完全相同，總體來說SAMP8小鼠目前是研究年齡相關(guān)學習和記憶缺陷基本機制較好的動物模型，可廣泛用于闡明學習記憶功能障礙的基本機制，研究老化相關(guān)性疾病，評價老化相關(guān)以及改善學習記憶功能的藥物，是很好的研究工具。

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