林紅賽 王春仁 王志杰 張華

1 中國食品藥品檢定研究院 （北京 100050）

2 華南理工大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究院 （廣州 510640）

3 蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 （蘇州 215021）

0.引言

細(xì)胞生物相容性評價是生物材料生物相容性評價的一項重要內(nèi)容，細(xì)胞毒性試驗作為檢測生物材料毒性的手段，具有簡便、敏感性高、節(jié)省動物、節(jié)約經(jīng)費、縮短生物材料研究周期等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于生物相容性評價。以往對生物材料的細(xì)胞生物相容性的評價往往只著眼于細(xì)胞的形態(tài)與數(shù)量的變化，隨后發(fā)展到對細(xì)胞生長、附著、增殖及代謝方面的影響，并提出了以有活力的細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞增殖能力作為評價生物材料細(xì)胞生物相容性的觀點。20世紀(jì)90年代初，有學(xué)者提出并確定了對生物材料進(jìn)行分子水平生物相容性研究的設(shè)想，借助分子生物學(xué)手段從分子水平研究生物材料對細(xì)胞行為的影響，進(jìn)而闡明生物材料對細(xì)胞作用的機(jī)制[1]。

細(xì)胞毒性試驗是生物材料細(xì)胞生物相容性評價最常用的方法，細(xì)胞毒性評價方法種類繁多，GB/T16886標(biāo)準(zhǔn)中按照材料與細(xì)胞的接觸方式，分為浸提液法（主要是MTT試驗法）、直接接觸法、分子濾過法和瓊脂覆蓋法。另有按照不同的生物學(xué)終點即不同評價指標(biāo)進(jìn)行分類的方法，如細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞膜效應(yīng)、細(xì)胞代謝活性、細(xì)胞增殖率等評價方法。近幾年也不斷涌現(xiàn)出新的細(xì)胞毒性試驗評價方法，如細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白檢測等。不同生物材料的細(xì)胞毒性機(jī)制往往不同，選擇多生物學(xué)終點評價方法可以初步探討材料細(xì)胞毒性的機(jī)制，同時綜合運用近幾年發(fā)展迅速的分子生物學(xué)方法可以更進(jìn)一步明確材料的毒性機(jī)理。本文主要就常用的評價指標(biāo)和評價方法及應(yīng)用進(jìn)展作一綜述，可為研究者在細(xì)胞生物相容性的方法選擇上提供參考。

2.傳統(tǒng)的多生物學(xué)終點細(xì)胞毒性評價方法

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)評價

一種發(fā)展最早的定性細(xì)胞損傷檢測方法，材料導(dǎo)致細(xì)胞損傷從而發(fā)生形態(tài)學(xué)的改變，通過顯微鏡下觀察到變圓或裂解細(xì)胞所占的百分比來估算細(xì)胞毒性級別。目測細(xì)胞毒性試驗方無法定量細(xì)胞毒性大小，但2008年Sujata[2]等對顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)毒性的定性判定方法與MTT法等定量細(xì)胞毒性判定法進(jìn)行了比較，研究得出Pearson相關(guān)系數(shù)為0.9，說明二者具有良好的相關(guān)性。此外，由于該方法可直觀地觀察到材料細(xì)胞毒性的大小，所以目前仍被廣泛用于生物材料細(xì)胞毒性的評價。

2.2 細(xì)胞膜效應(yīng)評價

(1) 中性紅攝取試驗（neutral red uptake，NRU）

檢測原理是未受損的細(xì)胞可攝取中性紅染料并將其蓄積在溶酶體內(nèi)，用中性紅染液洗脫劑（乙醇或乙酸）溶解中性紅，并通過酶標(biāo)儀檢測定量中性紅，活細(xì)胞攝入中性紅的水平與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。Borenfreund等[3]根據(jù)這一特性建立了中性攝取試驗法，并對幾種金屬材料的細(xì)胞毒性進(jìn)行了評價，認(rèn)為中性紅攝取試驗是細(xì)胞毒評價的快速評價方法。國際標(biāo)準(zhǔn)ISO 10993-5:2009已收錄該檢測方法及具體的操作步驟。

(2) 乳酸脫氫酶釋放法（LDH釋放法）

乳酸脫氫酶（LDH）是一種細(xì)胞胞漿內(nèi)酶，正常時僅存在于細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞受到損傷裂解時即釋放到細(xì)胞外，所以培養(yǎng)液中該酶活性與被裂解的細(xì)胞數(shù)量成正比。LDH釋放法只需測定培養(yǎng)后上清液的LDH活性，操作簡單，客觀性好并克服了形態(tài)學(xué)法的主要缺點。此外，由于LDH是一種糖醇解酶，廣泛存在于各種細(xì)胞中，這種酶僅在靶細(xì)胞變性時釋放出胞外，易檢測，無標(biāo)記過程，不存在防護(hù)問題，自發(fā)釋放率也小[5]。Issa等[6]采用MTT法和LDH釋放法檢測松香復(fù)合物（resin composite monomers）釋放出的單體的毒性大小，結(jié)果表明LDH釋放法較MTT法敏感，但二者均呈現(xiàn)了相似的細(xì)胞毒性等級。

2.3 細(xì)胞代謝活性評價

目前，以線粒體琥珀酸脫氫酶作為生物學(xué)終點的評價方法應(yīng)用最廣泛。線粒體病變被認(rèn)為是表示細(xì)胞受損傷最靈敏的指征之一，所以可以十分靈敏地反映出材料對細(xì)胞造成的毒性損害程度。

(1) MTT試驗

活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。該試驗過程簡便，自動化程度高，無需復(fù)雜、昂貴的儀器，已是目前應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞毒性評價方法之一。但是在測定過程中產(chǎn)生不溶于水的結(jié)晶產(chǎn)物，需要用DMSO溶解后才能測定光吸收值，若結(jié)晶物溶解不完全，會影響測定結(jié)果，所以MTT試驗法重復(fù)性略差。

(2) XTT試驗

在MTT試驗法的基礎(chǔ)上發(fā)展了XTT試驗法。XTT是一種與MTT類似的四唑氮衍生物，為線粒體脫氫酶的作用底物，可被活細(xì)胞還原形成水溶性的棕黃色的甲臜產(chǎn)物，與電子耦合劑如硫酸酚嗪甲酯（PMS）共同使用形成甲臜產(chǎn)物，該甲臜屬于水溶性產(chǎn)物，其生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正相關(guān)。Scudiero等[7]首次采用XTT體外細(xì)胞增殖和藥敏檢測，所得出的細(xì)胞生長曲線與MTT法檢測結(jié)果相似。Roehm等[8]的實驗結(jié)果顯示XTT法產(chǎn)生的甲臜多于MTT法，且實驗時間短、步驟簡便，認(rèn)為XTT比色法優(yōu)于MTT法。XTT已廣泛用于生物材料的相容性評價[9,10]。此外，與XTT類似的四唑氮衍生物還有MTS、WST-1，它們經(jīng)活細(xì)胞線粒體脫氫酶轉(zhuǎn)化亦形成水溶性有色物質(zhì)，可直接進(jìn)行比色，從而減少了實驗操作誤差。由于該法較MTT法具有明顯的優(yōu)點，已被納入國際標(biāo)準(zhǔn)ISO 10993-5:2009中，但實驗成本較MTT法高。

2.4 細(xì)胞增殖率評價

觀察材料或材料浸提液與細(xì)胞接觸后細(xì)胞生長速度和增殖率的改變，主要有克隆形成試驗?？寺⌒纬稍囼炇菣z測與生物材料作用后的細(xì)胞的克隆形成能力，用克隆形成率（實驗組的克隆數(shù)/對照組克隆數(shù)）評價材料的細(xì)胞毒性，最早由Tuchiya[16]等研究者提出。Kotoura等[12]在1985年用克隆形成試驗法對兩種金屬（鈦和鎳）、兩種陶瓷（氧化鋁陶瓷和磷酸鈣）及兩種聚合物（高密度聚乙烯和聚氯乙烯）進(jìn)行了細(xì)胞毒評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)克隆形成試驗可以用于毒性材料的篩選。Tuchiya等[11]選用分子濾過法、瓊脂覆蓋法、中性紅攝取法和克隆形成試驗（包括直接接觸法和浸提液法）對兩參照樣品（ZDEC-PU和ZDBC-PU）的毒性進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)克隆形成試驗（直接接觸法）較其他幾種方法敏感，并能檢測出微弱的細(xì)胞毒性。由于該方法的敏感性高，已收錄在國際標(biāo)準(zhǔn)ISO 10993-5:2009中。

2.5 DNA合成率檢測

通過直接測定進(jìn)行有絲分裂的細(xì)胞數(shù)來評價細(xì)胞的增殖能力，主要有5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）滲入法和胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）滲入法，3H-TdR滲入法因同位素3H具有放射性污染、操作復(fù)雜等缺點，沒有得到廣泛的應(yīng)用。5-溴脫氧核苷尿嘧啶為胸腺嘧啶的衍生物，在DNA合成期（S期）可代替胸腺嘧啶而被攝入合成DNA，測定結(jié)合了熒光燃料的抗BrdU單克隆抗體得出Brdu的攝入量，通過流式細(xì)胞儀或細(xì)胞酶聯(lián)反應(yīng)測定帶有標(biāo)記DNA的細(xì)胞所占比率，可以反映與材料接觸后的細(xì)胞的增殖能力。Dekker[13]等對MTT法、蛋白質(zhì)含量檢測法及5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）滲入法三種定量檢測方法進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）滲入法是最敏感的方法，但重復(fù)性略差。

3.細(xì)胞毒性評價方法的補(bǔ)充

3.1 細(xì)胞周期的檢測

近些年通過檢測細(xì)胞周期來評價生物材料細(xì)胞毒性的研究報道日趨增多。細(xì)胞周期檢測需借助流式細(xì)胞儀技術(shù)（FCM），其利用鞘流原理，使被熒光標(biāo)記的單個懸浮細(xì)胞排成單列，按重力方向流動。細(xì)胞被激光照射后發(fā)射熒光，檢測器可逐個對細(xì)胞的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測定，F(xiàn)CM對細(xì)胞測定能力是30萬～60萬個細(xì)胞/分鐘，同時可對細(xì)胞的核酸、蛋白質(zhì)、酶、細(xì)胞周期分布等多種參數(shù)進(jìn)行測定。該技術(shù)在材料的生物相容性評價中已有著廣泛的應(yīng)用價值。1998年，MA[14]等用流式細(xì)胞儀技術(shù)評價羥基磷灰石（HA）復(fù)合材料的生物相容性，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察法未觀察到細(xì)胞毒性，但FCM分析得出HA的組成成分會影響細(xì)胞周期。戴建國[25]等人用流式細(xì)胞儀檢測羥基磷灰石浸提液對L929細(xì)胞生長周期及凋亡的影響，進(jìn)而評價其生物相容性，并期望探討將細(xì)胞周期檢測作為生物材料細(xì)胞生物相容性的重要補(bǔ)充。Reza等[16]提出FCM可以作為牙科材料理想且實用的細(xì)胞毒性評價方法。Zhang等[17]采用了MTT法、FCM和RT-PCR三種方法對五種口腔修復(fù)材料進(jìn)行了細(xì)胞毒評價，結(jié)果顯示FCM和RTPCR兩種方法更加敏感，并建議作為傳統(tǒng)細(xì)胞毒評價方法的重要補(bǔ)充。

3.2 細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白檢測

Ki-67是一種與細(xì)胞周期相關(guān)的增殖細(xì)胞核抗原，Ki-67表達(dá)于所有的增殖細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，是檢測細(xì)胞增殖的標(biāo)志性核抗原。Ki-67表達(dá)于細(xì)胞周期的G1、S1和G2期而在G0期無表達(dá)，2000年klein等[18]對將Ki-67蛋白含量作為細(xì)胞增殖評價方法進(jìn)行了研究，并與傳統(tǒng)的細(xì)胞毒評價方法進(jìn)行了對比，他認(rèn)為ELISA法檢測Ki-67蛋白含量的方法是一種快速可靠、無放射污染的細(xì)胞增殖率評價的新方法，并建議作為國際標(biāo)準(zhǔn)ISO 10993-5細(xì)胞毒性評價的補(bǔ)充方法。3.3熱休克蛋白檢測

熱休克蛋白含量檢測是含汞牙科材料細(xì)胞毒性研究的一種評價方法。熱休克蛋白(heat shock protein，HSP) 與細(xì)胞間反應(yīng)密切相關(guān), 是細(xì)胞反應(yīng)的一個標(biāo)志性分子，也是公認(rèn)的在多種生物過程中起作用的重要蛋白質(zhì)[19]。細(xì)胞在受到外界刺激時，熱休克蛋白參與細(xì)胞自我保護(hù)和細(xì)胞損傷的修復(fù)。Oshima等1997年提出熱休克蛋白的檢測可以作為牙科材料細(xì)胞毒評價新方法的可能性[20]，隨后他又采用熱休克蛋白(HSP70) mRNA含量檢測法對含汞牙科材料進(jìn)行了毒性評價，提出熱休克蛋白(HSP70)含量檢測可以作為含汞牙科材料的細(xì)胞毒評價方法，且較傳統(tǒng)的中性紅比色法敏感[21]。

4.細(xì)胞毒性機(jī)制研究及其研究方法

事實上如果生物材料對機(jī)體的影響已經(jīng)在整體水平和細(xì)胞水平上表現(xiàn)出來，那么在分子水平的基因表達(dá)方面勢必已經(jīng)造成影響，并且會極靈敏地反映出來。所以借助分子生物學(xué)等研究方法可以從分子水平上了解材料與細(xì)胞相互作用的機(jī)制。目前常用的研究方法包括流式細(xì)胞儀技術(shù)、細(xì)胞原位雜交法、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和DNA微陣列技術(shù)等。如Gu等[22]對絲素纖維與外周神經(jīng)組織的體外生物相容性進(jìn)行了研究，MTT法評價絲素纖維對細(xì)胞活力的改變，流式細(xì)胞儀技術(shù)評估細(xì)胞的增殖能力，RT-PCR法檢測絲素纖維對雪旺氏細(xì)胞神經(jīng)生長因子(NGF)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF) mRNA的含量，綜合評價出絲素纖維與外周神經(jīng)組織的體外生物相容性良好。寧麗等[23]采用細(xì)胞原位雜交試驗觀察醫(yī)用硅橡膠對體外原代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞骨橋蛋白（osteopontin）的mRNA基因表達(dá)的影響，結(jié)果顯示無毒性的硅橡膠不影響成骨細(xì)胞骨橋蛋白mRNA基因表達(dá)，有細(xì)胞毒性的硅橡膠則抑制骨橋蛋白mRNA在成骨細(xì)胞中的表達(dá)。呂曉迎等[24]采用MTT法和基因表達(dá)圖譜分析法對鎳離子細(xì)胞毒性及毒性機(jī)制進(jìn)行了研究。章非敏等[25]著重研究口腔材料生物相容性評價的新方法，利用流式細(xì)胞儀技術(shù)和RT-PCR法對5種牙體修復(fù)材料的細(xì)胞毒性和毒性機(jī)理進(jìn)行了初步的探討。綜合以上研究，生物材料細(xì)胞毒性機(jī)制層面的研究，為從分子水平上評價材料的生物相容性提供了實驗依據(jù)，也是常規(guī)細(xì)胞毒性評價的重要補(bǔ)充。

5.結(jié)語

綜上所述，評價生物材料的體外細(xì)胞生物相容性試驗方法較多，亦各有其特點。各試驗方法之間雖然存在一定的相關(guān)性，但是很難達(dá)到完全一致性。眾多研究表明，不同細(xì)胞毒性評價方法對不同生物材料的敏感程度不同，原因可能在于不同的化學(xué)物質(zhì)其毒理作用機(jī)制不同，而立足于不同生物學(xué)終點的評價方法顯示出了不同的敏感度。2005年Weyermann等[26]對MTT法、LDH法和NUR試驗三種試驗方法進(jìn)行了比較，并研究其毒性機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LDH試驗對于細(xì)胞膜完整性的破壞較敏感，而對于影響細(xì)胞內(nèi)活動的一些毒性物質(zhì)反應(yīng)不敏感；MTT試驗法主要對影響線粒體酶活性的毒性反應(yīng)敏感，對于溶酶體破壞相關(guān)的細(xì)胞毒性，NUR檢測靈敏度較高。因此在選擇試驗方法時，必須根據(jù)“最接近應(yīng)用狀況”的原則，合理地選擇樣品與細(xì)胞的接觸方式和檢測生物學(xué)終點的評價指標(biāo)或評價方法。綜合運用分子水平評價方法，闡明材料對細(xì)胞的作用機(jī)制，全面地評價生物材料對細(xì)胞的毒性作用，將是生物材料細(xì)胞生物相容性評價的發(fā)展方向。

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