董長(zhǎng)征,李文玲,趙文清,岳向勇,郭 韜,康進(jìn)生

(河北省人民醫(yī)院,石家莊 050051)

迄今為止,低劑量伽瑪?shù)墩丈渲委煿δ軈^(qū)癲癇的機(jī)制尚未完全闡明[1],近年研究證實(shí),腦神經(jīng)元凋亡與癲癇發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[2]。貓腦額葉乙狀前回是貓的運(yùn)動(dòng)功能區(qū)中樞。2007年 5月 ～2007年 8月,我們觀察了低劑量伽瑪?shù)墩丈鋵?duì)功能區(qū)癲癇貓模型行為及腦額葉功能區(qū)皮層神經(jīng)元顯微結(jié)構(gòu)的影響,探討低劑量伽瑪?shù)墩丈淇拱d癇發(fā)作的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器 健康成年貓 80只,均為雄性,體質(zhì)量2.5～3.5 kg;注射用青霉素,異丙酚(200 mg/支);Signa 1.5 T核磁共振儀,LEKSELL B型伽瑪?shù)?生物信號(hào)定量記錄分析系統(tǒng)(MS4000U-1型)。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模 將 80只貓隨機(jī)分成正常對(duì)照組(A組)、癲癇模型組(B組)、伽瑪?shù)吨委熃M(C組)。A組24只不做任何處理;B、C組各28只,均用貓額功能區(qū)皮質(zhì)多次注射青霉素法制作點(diǎn)燃癲癇模型[3],凡顯示連續(xù)出現(xiàn) 5次Ⅲ級(jí)以上驚厥為達(dá)到點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn)。C組造模成功后給予伽瑪?shù)墩丈渲委煛?/p>

1.2.2 照射方法 C組動(dòng)物用3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉,將其頭部安裝于Leksell立體定向頭架;用MRI行無(wú)間隔定位掃描,層厚2 mm;掃描圖像經(jīng)計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)傳至Gamma Plan系統(tǒng)制定治療計(jì)劃,確定照射靶區(qū)位于右側(cè)額葉的X-Y-Z坐標(biāo)。將固定貓腦的Leksell框架按所定坐標(biāo)安放在伽瑪?shù)抖ㄎ患苌?用 4mm準(zhǔn)直器,對(duì)靶區(qū)腦組織實(shí)施照射,邊緣劑量為15Gy。

1.2.3 行為學(xué)觀察方法 采用Smialowki 6級(jí)評(píng)分法[4]貓行為學(xué)變化。于伽瑪?shù)墩丈浜?4、8、12周,A組取6只,B、C組各 10只再次給予腦額葉皮層青霉素注射,觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的發(fā)作級(jí)別,以出現(xiàn)Ⅳ ～Ⅵ級(jí)發(fā)作為重度發(fā)作,僅出現(xiàn)Ⅲ級(jí)或Ⅲ級(jí)以下為輕度發(fā)作。

1.2.4 腦額葉功能區(qū)皮層神經(jīng)顯微結(jié)構(gòu)觀察及神經(jīng)元數(shù)目測(cè)定 于伽瑪?shù)墩丈浜?4、8、12周,各組取18只,用3%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉。開(kāi)胸后,經(jīng)左心室至升主動(dòng)脈插管,用冷的(4℃)含4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸緩沖液(PBS,pH 7.4)500 ml行灌流固定。開(kāi)顱取出照射靶區(qū)腦組織,置于4%多聚甲醛后固定6 h;入200 g/L蔗糖溶液,4℃過(guò)夜;冰凍切片機(jī)做皮層垂直斷面冰凍切片,片厚 14μm。采用蘇木精—伊紅染色,光鏡下觀察各組動(dòng)物不同時(shí)相腦額葉功能區(qū)皮層神經(jīng)顯微結(jié)構(gòu)變化,并計(jì)數(shù)神經(jīng)元數(shù)目。應(yīng)用Leica Qwin圖像分析軟件,每張切片取 5個(gè) 400倍視野,測(cè)定每個(gè)視野的神經(jīng)元個(gè)數(shù),然后計(jì)算平均細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS8.0軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用±s表示,組間比較采用方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組行為學(xué)觀察結(jié)果比較 A組各時(shí)點(diǎn)均未出現(xiàn)癇性發(fā)作,B組造模成功后 4、8、12周重度發(fā)作率分別為90%、80%、80%,而C組重度發(fā)作率分別為70%、60%、30%。在12周時(shí),C組與 B組比較, P＜0.05。

2.2 各組腦額葉功能區(qū)皮層神經(jīng)元數(shù)目及顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)改變 A組大腦額葉皮層神經(jīng)元邊界清晰,細(xì)胞核呈圓形、橢圓形,染色質(zhì)在核內(nèi)分布較均勻,核仁清晰。從第 8周開(kāi)始,B組細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯異常,殘存神經(jīng)元胞核、胞質(zhì)深染,邊緣不清,胞核內(nèi)染色質(zhì)凝聚成塊狀、邊集,甚至核固縮;部分細(xì)胞胞質(zhì)溶解,出現(xiàn)空泡狀結(jié)構(gòu),有的整個(gè)神經(jīng)元呈濃縮狀態(tài),體積縮小;可見(jiàn)紅色神經(jīng)元、噬神經(jīng)現(xiàn)象及衛(wèi)星現(xiàn)象。C組神經(jīng)元細(xì)胞核大而圓且染色淺,神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)空泡減少,胞質(zhì)增多,未見(jiàn)核固縮及核溶解現(xiàn)象。各組腦額葉功能區(qū)皮層神經(jīng)元數(shù)目比較,見(jiàn)表 1。

表1 各組不同時(shí)相貓腦額葉功能區(qū)皮層神經(jīng)元數(shù)目比較(個(gè),±s)

表1 各組不同時(shí)相貓腦額葉功能區(qū)皮層神經(jīng)元數(shù)目比較(個(gè),±s)

注:與A組比較,＊P＜0.05;與B組比較,#P＜0.05

組別 n 4周 8周 12周A組 18 275±56 270±37 271±15 B組 18 231±39 196±14＊ 174±57＊C組 18 246±24 251±48 264±76#

3 討論

既往研究證實(shí),長(zhǎng)期反復(fù)癲癇發(fā)作可導(dǎo)致包括腦神經(jīng)元凋亡在內(nèi)的神經(jīng)元的死亡,人和動(dòng)物癲癇病灶中也存在神經(jīng)元數(shù)目減少現(xiàn)象[5,6]。目前,關(guān)于伽瑪?shù)吨委煿δ軈^(qū)癲癇的機(jī)制尚不十分清楚。推測(cè)可能是由于低劑量的伽瑪射線(xiàn)導(dǎo)致癲癇神經(jīng)元持續(xù)的、非破壞性的結(jié)構(gòu)性改變,即神經(jīng)元的可塑性發(fā)生變化[7～10],包括:①癲癇神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)變化;②癲癇神經(jīng)元的活性降低,如興奮性氨基酸濃度減少;③癲癇神經(jīng)元的傳導(dǎo)阻滯,如電鏡下發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元突觸缺失;④癲癇神經(jīng)元的直接破壞(放射性壞死)。

本研究在成功建立青霉素慢性點(diǎn)燃癲癇動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上,從結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)改變來(lái)探討伽瑪?shù)吨委煿δ軈^(qū)癲癇的效果及作用機(jī)制。結(jié)果在照射后 12周時(shí),伽瑪?shù)墩丈浣M發(fā)作級(jí)別較模型組明顯減輕,且試驗(yàn)動(dòng)物無(wú)明顯肢體活動(dòng)障礙。這表明低劑量伽瑪?shù)墩丈淇梢越档蛣?dòng)物的發(fā)作級(jí)別,對(duì)功能區(qū)癲癇發(fā)作起到抑制作用,而且不產(chǎn)生明顯的神經(jīng)功能缺失。本研究結(jié)果顯示,通過(guò)青霉素慢性點(diǎn)燃癲癇模型后,觀察到癲癇模型組貓腦額葉功能區(qū)皮層神經(jīng)元數(shù)目明顯減少,且有的整個(gè)神經(jīng)元呈濃縮狀態(tài),甚至出現(xiàn)核固縮,說(shuō)明慢性癲癇動(dòng)物模型的腦功能區(qū)皮層神經(jīng)元數(shù)目減少,且出現(xiàn)典型的凋亡神經(jīng)元的形態(tài)特征;而且,神經(jīng)元隨時(shí)間延長(zhǎng)可見(jiàn)到細(xì)胞損傷呈進(jìn)行性加重。而伽瑪?shù)吨委熃M,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷均減輕,凋亡細(xì)胞減少,整個(gè)細(xì)胞溶解及空化現(xiàn)象減輕,細(xì)胞輕度腫脹。這表明癲癇發(fā)作時(shí)間越久,損傷越重,說(shuō)明腦功能區(qū)皮層結(jié)構(gòu)損傷與長(zhǎng)時(shí)間抽搐發(fā)作引起的缺氧、缺血性變化有一定的關(guān)系。低劑量伽瑪?shù)墩丈淠軌蜉^好地抑制慢性癲癇模型中腦皮層神經(jīng)元數(shù)目的減少及神經(jīng)元凋亡,可能與伽瑪?shù)墩丈浜蟀l(fā)作停止或減少,從而減少發(fā)作帶來(lái)的腦的缺氧、缺血所致的細(xì)胞凋亡有關(guān)。這可能是伽瑪?shù)吨委煿δ軈^(qū)癲癇的另一重要機(jī)制,其他的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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