嚴(yán) 偲，劉青梅，楊性民

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201300；2.浙江萬(wàn)里學(xué)院寧波市農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315100）

寧波水磨年糕屬地方著名傳統(tǒng)特產(chǎn)，是以粳米為原料，經(jīng)浸泡、水磨、壓榨、蒸粉、擠壓成型、冷卻等多道工序加工而成的一種傳統(tǒng)食品，口感爽滑、韌性可口，深受消費(fèi)者喜愛(ài)[1-2]。但由于年糕主要成分為淀粉，含水量和水分活度較高，很容易受到細(xì)菌和霉菌污染引起酸敗發(fā)霉，保質(zhì)期短。本試驗(yàn)就年糕保鮮這一主題，運(yùn)用 ε-聚賴氨酸[3]、溶菌酶[4]、乳酸鏈球菌素[5]、納它霉素[6]等高效生物防腐保鮮劑，以殼聚糖[7-8]為載體，對(duì)年糕進(jìn)行涂膜保鮮。采用響應(yīng)面法（RSM），建立回歸方程模型，找出最優(yōu)組合，配制復(fù)合保鮮劑，降低年糕中腐敗微生物的含量，從而達(dá)到保鮮的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料與試劑 年糕：寧波慈城馮恒大年糕廠；菌落計(jì)數(shù)、孟加拉紅培養(yǎng)基：杭州微生物試劑有限公司；ε-聚賴氨酸、乳酸鏈球菌素、納它霉素：中國(guó)銀象生物工程有限公司；溶菌酶：Sigma公司；甘氨酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；殼聚糖：寧波市鎮(zhèn)海海鑫生物制品有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備 手提式高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械有限公司；BLON-8型無(wú)菌均質(zhì)器：上海比朗儀器有限公司；DZ-400真空包裝機(jī)：上海青葩食品包裝機(jī)械有限公司；SPX型智能生化培養(yǎng)箱：寧波江南儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 單因素試驗(yàn) 以1%殼聚糖為載體，試驗(yàn)分別采用 ε-聚賴氨酸（ε-PL）+0.01%醋酸[9]、溶菌酶+6%甘氨酸[4]、乳酸鏈球菌素（Nisin）、納它霉素溶液浸涂年糕，研究ε-PL、溶菌酶、Nisin對(duì)年糕中細(xì)菌的抑制作用效果以及納它霉素對(duì)年糕中霉菌和酵母的抑制作用效果。

1.2.2 復(fù)合因子響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，應(yīng)用RSM原理，采用中心組合設(shè)計(jì)（CCD）,選取 ε-PL、溶菌酶、Nisin 三個(gè)因素為自變量，分別用A、B、C表示，每個(gè)因素取5個(gè)水平，以抑菌率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)。試驗(yàn)因素水平編碼見(jiàn)表1。采用Design Expert 7.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 因素水平編碼 （%）

1.2.3 微生物檢測(cè)方法 菌落總數(shù)的測(cè)定：參照國(guó)標(biāo)GB/T 4789.2-2010；霉菌和酵母計(jì)數(shù)：參照國(guó)標(biāo)GB/T 4789.15-2010；抑菌率=（lg對(duì)照樣品菌落總數(shù)－lg保鮮樣品菌落總數(shù)）/lg對(duì)照樣品菌落總數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 ε-PL對(duì)年糕中細(xì)菌的抑制作用 由圖1可以看出，ε-PL對(duì)年糕中的細(xì)菌抑制效果明顯，隨著ε-PL濃度的增加，菌落總數(shù)明顯減少，二者呈正相關(guān)關(guān)系；當(dāng)ε-PL濃度大于0.2%時(shí)，ε-PL對(duì)年糕中細(xì)菌的抑制作用不再明顯。

圖1 不同濃度ε-聚賴氨酸對(duì)年糕中細(xì)菌的抑制效果

2.1.2 溶菌酶對(duì)年糕中細(xì)菌的抑制作用 由圖2可以看出，溶菌酶對(duì)年糕中的細(xì)菌有著較好的抑制效果，當(dāng)溶菌酶濃度達(dá)到0.05%時(shí)，抑制效果最好；濃度繼續(xù)增加，抑制效果反而不好，這與文 獻(xiàn)[4]報(bào)道中溶菌酶使用的最適濃度為0.05%保持一致，說(shuō)明其在年糕等糕團(tuán)食品中亦可使用。

圖2 不同濃度溶菌酶對(duì)年糕中細(xì)菌的抑制效果

2.1.3 乳酸鏈球菌素（Nisin）對(duì)年糕中細(xì)菌的抑制作用 由圖3可以看出，添加Nisin可以明顯抑制年糕中的細(xì)菌，當(dāng)Nisin濃度達(dá)到0.02%時(shí)，抑制效果最顯著，這一結(jié)果與劉青梅等[2]研究結(jié)果一致。

圖3 不同濃度乳酸鏈球菌素對(duì)年糕中細(xì)菌的抑制效果

2.1.4 納它霉素對(duì)年糕中真菌的抑制作用 為了提高對(duì)年糕中霉菌的抑制作用，保證保鮮效果，試驗(yàn)在配制復(fù)合保鮮液的過(guò)程中添加納它霉素，其對(duì)年糕中真菌的抑制作用的試驗(yàn)效果見(jiàn)圖4。從圖4中可以看出，隨著納它霉素濃度的增加，霉菌和酵母計(jì)數(shù)結(jié)果亦隨之下降，當(dāng)納它霉素濃度達(dá)到0.04%時(shí)，從菌落形態(tài)觀察，基本無(wú)霉菌生長(zhǎng)，雖未能完全抑制酵母菌的生長(zhǎng)，但年糕表面已無(wú)霉斑產(chǎn)生，考慮到納它霉素的添加劑量標(biāo)準(zhǔn)[10]，在本試驗(yàn)中將納它霉素的添加量確定為0.04%。

圖4 不同濃度納它霉素對(duì)年糕中真菌的抑制效果

2.2 復(fù)合因子對(duì)年糕中細(xì)菌的抑制作用

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 試驗(yàn)對(duì)年糕中細(xì)菌起主要抑制作用的三個(gè)因子（ε-PL、溶菌酶、Nisin）進(jìn)行響應(yīng)面組優(yōu)化試驗(yàn)，采用CCD設(shè)計(jì)，以抑菌率為響應(yīng)值進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 CCD設(shè)計(jì)方案及結(jié)果 （%）

2.2.2 回歸模型的建立與方差分析 對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，獲得抑菌率的預(yù)測(cè)值對(duì)ε-PL、溶菌酶、nisin的二次多元回歸方程：

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析和系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

由方差分析可知：（1）此模型的P＜0.000 1，響應(yīng)面回歸模型達(dá)到高度顯著水平，其中決定系數(shù)R2=0.990 4，說(shuō)明99%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以用此方程解釋，失擬項(xiàng)在0.01水平上不顯著，回歸模型的擬合程度較好，可以用此模型進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。（2）回歸方程分析：一次項(xiàng) A、B、C 均為 P＜0.000 1，說(shuō)明 ε-PL、溶菌酶、Nisin這三個(gè)因子對(duì)抑菌率的影響都極其顯著，抑菌效果為ε-PL＞Nisin＞溶菌酶；AC交互項(xiàng)P值為 0.026 7，在0.01＜P≤0.05范圍內(nèi)，說(shuō)明ε-PL和Nisin之間的交互作用顯著；同理，AB、BC對(duì)響應(yīng)值不顯著，說(shuō)明ε-PL和溶菌酶之間的交互作用不顯著，溶菌酶和Nisin之間的交互作用不顯著。

2.2.3 響應(yīng)曲面和等高線圖解析 將一個(gè)因子固定在0水平，分析其余兩個(gè)因子間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，響應(yīng)曲面和等高線圖見(jiàn)圖5~7。響應(yīng)面回歸模型高度顯著，抑菌效果：ε-PL＞Nisin＞溶菌酶。

表3 響應(yīng)面二次回歸模型方差分析

圖5 Y=f（A，B）的響應(yīng)曲面（C=0.2）

圖6 Y=f（A，C）的響應(yīng)曲面（B=0.05）

由圖5可以看出，等高線曲率較小，形狀近似橢圓，說(shuō)明ε-PL與溶菌酶之間存在著交互作用。當(dāng)ε-PL的含量一定時(shí)，隨著溶菌酶含量的不斷增加，抑菌率先隨之增加，后又有所下降。這可能跟溶菌酶的特殊性有關(guān)，主要對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有溶菌作用，然而年糕中的腐敗菌不只是革蘭氏陽(yáng)性菌，還有其他微生物。若溶菌酶濃度過(guò)大，與年糕表面接觸的ε-PL濃度就相對(duì)下降，抑菌效果反而不好。

圖7 Y=f（B，C）的響應(yīng)曲面（A=0.2）

由圖6可以看出，等高線曲率較小，形狀近似橢圓，說(shuō)明ε-PL與Nisin之間存在著交互作用。又由顯著性檢驗(yàn)結(jié)果（P＜0.05）可知，二者之間交互作用影響顯著。當(dāng)ε-PL的含量一定時(shí)，Nisin濃度增加，抑菌率隨之增加；當(dāng)Nisin含量增加到一定程度后，Nisin濃度繼續(xù)增加，抑菌率反而減小。這可能與ε-PL和Nisin的抑菌機(jī)理相關(guān)，二者均為從微生物發(fā)酵產(chǎn)物中提取合成的多肽化合物，ε-PL是通過(guò)靜電粘附于細(xì)胞膜表面，同時(shí)作用于蛋白和細(xì)胞膜的合成系統(tǒng)，與核糖體結(jié)合抑制蛋白和酶的合成，從而達(dá)到殺菌的目的[3]；Nisin是通過(guò)一個(gè)特別的對(duì)接分子附著在原生質(zhì)膜上，創(chuàng)造了一個(gè)由幾個(gè)Nisin分子組成的孔形成單位，這種相互作用導(dǎo)致細(xì)胞膜上形成暫時(shí)的氣孔，消除細(xì)胞的離子梯度，使細(xì)胞裂解死亡[11]。因此，一定濃度的ε-PL和Nisin復(fù)配，隨著Nisin濃度增加，可起到協(xié)同增效的作用，這與李誠(chéng)等[3]研究結(jié)果是一致的。但當(dāng)Nisin濃度過(guò)高時(shí)，與年糕表面接觸的ε-PL濃度就相對(duì)下降，抑菌效果也就隨之降低了。

由圖7可以看出，等高線形狀近似圓形，說(shuō)明溶菌酶和nisin之間的交互作用不顯著。

2.3 復(fù)合保鮮劑最佳組合的確定

由軟件分析得出復(fù)合保鮮劑的的最佳組合：ε-PL為0.3%、溶菌酶為0.06%、Nisin為0.02%，理論最佳抑菌率為0.76。結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，考慮到溶菌酶成本等，將復(fù)合保鮮劑主要成分修正成ε-PL為0.3%、溶菌酶為0.05%、Nisin為0.02%，預(yù)測(cè)抑菌率為0.73。

采用修正后的復(fù)合保鮮劑組合做年糕保鮮的驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次，實(shí)測(cè)抑菌率為0.69，與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差5%。

3 結(jié)論

（1）單因素試驗(yàn)結(jié)果表明：ε-聚賴氨酸對(duì)年糕中細(xì)菌的抑制作用效果最為顯著，納它霉素對(duì)年糕中霉菌有較好的抑制作用。

（2）多因素試驗(yàn)結(jié)果表明：三種保鮮劑對(duì)年糕的防腐保鮮效果為ε-PL＞Nisin＞溶菌酶。二次回歸模型分析（R2=0.990 4），表明模型擬合程度好。

（3）響應(yīng)曲面分析：ε-聚賴氨酸和Nisin之間等高線形狀近似橢圓，顯著性檢驗(yàn)結(jié)果（P＜0.05），可見(jiàn)ε-聚賴氨酸和Nisin之間交互作用影響顯著，二者復(fù)配可起到協(xié)同增效的作用。ε-PL與溶菌酶之間等高線形狀近似橢圓，說(shuō)明ε-PL與溶菌酶之間存在交互作用。溶菌酶和Nisin之間等高線形狀近似圓形，說(shuō)明溶菌酶和Nisin之間的交互作用不顯著。

（4）綜合考慮，年糕復(fù)合保鮮劑成分為：殼聚糖1%、ε-聚賴氨酸0.3%、醋酸0.1%、溶菌酶0.05%、甘氨酸6%、乳酸鏈球菌素（Nisin）0.02%、納它霉素0.04%。該復(fù)合年糕保鮮劑預(yù)測(cè)抑菌率為0.73。實(shí)測(cè)抑菌率為0.69，與理論值相對(duì)誤差5%。

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