周 慧，劉夢(mèng)源，楊 冰，程先超，王潤(rùn)玲

（1.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津300070；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300192）

朊蛋白(prion protein,PrP)是一種不同于細(xì)菌、病毒或類病毒的在分類上尚未定論的病原因子[1-5]。其本質(zhì)為由正常宿主細(xì)胞基因編碼的、構(gòu)象異常的蛋白質(zhì)，目前尚未檢出任何核酸成分，是人和動(dòng)物的傳染性海綿狀腦?。╰ransmissible spongiform encephalopathies,TSEs）的病原體。能造成哺乳動(dòng)物腦部病變的是PrPSC（傳染型PrP），另一種是不具有侵染力的PrPC（細(xì)胞型PrP）。有觀點(diǎn)認(rèn)為是由正常形式的蛋白錯(cuò)誤折疊成致病蛋白而形成的，兩種結(jié)構(gòu)異型的蛋白PrPC和PrPSC來(lái)源于同一基因，具有相同的氫基酸序列和共價(jià)修飾，但是其理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)有很大的差異。目前研究表明，朊蛋白E200K突變會(huì)使PrPC轉(zhuǎn)變?yōu)镻rPSC[6-9]導(dǎo)致人和動(dòng)物的傳染性海綿狀腦病，但其轉(zhuǎn)變機(jī)制尚不明確。本研究采用分子動(dòng)力學(xué)的方法，進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間分子動(dòng)力學(xué)模擬，研究E200K突變所導(dǎo)致的朊蛋白變構(gòu)過(guò)程。

1 材料與方法

1.1 分子動(dòng)力學(xué)模型構(gòu)建 從布魯克海文蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（RCSB data bank,http://www.rcsb.org）下載人的野生型朊蛋白NMR結(jié)構(gòu)（PDB ID:1QM0）和人的E200K突變型朊蛋白NMR結(jié)構(gòu)（PDB ID:1QM2）。

利用Desmond 9.0分子動(dòng)力學(xué)軟件包[10-11]向上述兩個(gè)人朊蛋白模型中加入溶劑分子，溶劑分子采用簡(jiǎn)單點(diǎn)電荷水分子（SPC水分子），周期邊界條件中將生成的盒子形狀定為Cubic，盒子的Buffer值為10?。向體系中加入反離子，使模擬體系達(dá)到電中性，同時(shí)再向體系中加入0.15mol/L的氯化鈉，使整個(gè)體系與人體體液環(huán)境等滲。

1.2 分子動(dòng)力學(xué)模擬條件 分子動(dòng)力學(xué)模擬采用等溫等壓系綜，鍵長(zhǎng)限制算法為SHAKE，溫度耦合方法為Nose-Hoover，模擬溫度為300K，弛豫時(shí)間為1ps。壓力耦合方法為Martyna-Tobias-Klein，弛豫時(shí)間為2ps，模擬壓力為1.01325bar（1bar=100000Pa），Couplingstyle為Isotropic，可壓系數(shù)為4.5×10-5。短程靜電相互作用閾值為9?，長(zhǎng)程靜電作用計(jì)算采用Smooth particle mesh Ewald（PME）[12-13]。為防止朊蛋白在分子動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中本身部分移出盒子外，給朊蛋白中心殘基的α碳原子施加2kcal/mol/ ?2的力。積分步長(zhǎng)為2fs，首先平衡500ps，平衡采用Desmond默認(rèn)的Relaxation protocol，再進(jìn)行10ns的正式分子動(dòng)力學(xué)模擬。在模擬過(guò)程中，每2ps記錄一次軌跡文件。

2 結(jié)果

2.1 人朊蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu) 圖1為人朊蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)模型緞帶圖，由圖可以看出人朊蛋白主要由3個(gè)α螺旋組成，其中α1螺旋包括144～152殘基，α2螺旋包括174～193殘基，α3螺旋包括200～228殘基。朊蛋白的N端主要包括一些loop結(jié)構(gòu)，C端主要以α螺旋為主。

圖1 人朊蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)圖Fig 1 The secondary structure of human prion protein

2.2 E200K突變對(duì)朊蛋白整體結(jié)構(gòu)影響

2.2.1 野生型和E200K突變型朊蛋白Cα的均方根偏差（root mean square deviation,RMSD）隨時(shí)間變化比較 野生型（WT）朊蛋白在10ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中RMSD值變化不大，從1?逐漸升高到2?，而E200K突變型朊蛋白R(shí)MSD變化非常明顯，在前4000ps內(nèi)，RMSD值從1?迅速升高到4.5?，此后基本在4～5?范圍內(nèi)波動(dòng)，見圖2。

圖2 野生型和E200K突變型朊蛋白Cα的RMSD隨時(shí)間變化曲線Fig 2 RMSD of α-carbon atoms of wild type and E200K mutant prion protein

從RMSD隨時(shí)間變化曲線可以看出，野生型朊蛋白在10ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中結(jié)構(gòu)波動(dòng)不大，但突變型朊蛋白R(shí)MSD波動(dòng)很大，說(shuō)明在分子動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中，結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化。

2.2.2 野生型和E200K突變型朊蛋白Cα的均方根波動(dòng)（root mean square fluction，RMSF）隨時(shí)間變化比較 野生型的朊蛋白R(shí)MSF在1～3?之間保持穩(wěn)定波動(dòng)，突變型的朊蛋白R(shí)MSF在C端殘基RMSF值較大，在8?左右，見圖3。

圖3 野生型和E200K突變型朊蛋白Cα的RMSF變化曲線Fig 3 RMSF of α-carbon atoms of wild type and E200K mutant prion protein

從RMSF曲線圖可以看出，相對(duì)于分子動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中的平均結(jié)構(gòu)而言，突變型朊蛋白C端殘基骨架波動(dòng)很大，說(shuō)明在突變型的朊蛋白的C端蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化。

2.2.3 分子動(dòng)力學(xué)模擬10ns后人朊蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化 圖4是10ns后的人朊蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)圖，由此圖可以看出，E200K會(huì)導(dǎo)致α2和α3螺旋發(fā)生解旋，同時(shí)，在10ns分子動(dòng)力學(xué)模擬后，相比野生型朊蛋白，E200K突變型朊蛋白的β折疊會(huì)延長(zhǎng)，因此，需進(jìn)一步分析造成上述結(jié)構(gòu)變化的原因。

圖4 10ns后人朊蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)圖Fig 4 The secondary structure of human prion protein after 10ns MD simulations

2.2.3.1 α2螺旋骨架氫鍵概率統(tǒng)計(jì)情況：由表1可以看出，E200K的突變會(huì)使朊蛋白α2螺旋大部分骨架氫鍵穩(wěn)定程度降低，從而導(dǎo)致突變體的α2螺旋在10ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬后出現(xiàn)解旋現(xiàn)象。

表1 α2螺旋骨架氫鍵概率統(tǒng)計(jì)情況Tab 1 Hydrogen bond occupancy of α2 helix backbone hydrogen bonds

2.2.3.2 α3螺旋骨架氫鍵概率統(tǒng)計(jì)情況：由表2可以看出，E200K的突變會(huì)使朊蛋白α3螺旋骨架中Ser222與Tyr226、Ala224與Arg228氫鍵穩(wěn)定程度降低，所以E200K會(huì)使C端的α3螺旋骨架氫鍵穩(wěn)定程度降低，從而導(dǎo)致突變體的α3螺旋在10ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬后出現(xiàn)解旋的現(xiàn)象。

表2 α3螺旋骨架氫鍵概率統(tǒng)計(jì)情況Tab 2 Hydrogen bond occupancy of α3helix backbone hydrogen bonds

2.2.3.3 β折疊氫鍵概率統(tǒng)計(jì)情況：由表3可見，野生型和E200K突變型朊蛋白β折疊區(qū)域殘基骨架氫鍵概率影響不是很大。除Gly131骨架的羰基與Val161骨架的氨基形成氫鍵的概率較低外，其它殘基骨架氫鍵概率非常高。因此可以看出，E200K突變對(duì)朊蛋白β折疊區(qū)域殘基骨架氫鍵穩(wěn)定性影響不是很大。

表3 β折疊氫鍵概率統(tǒng)計(jì)情況Tab 3 Hydrogen bond occupancy of β sheet backbone hydrogen bonds

3 討論

3.1 PrPC和PrPSC理化性質(zhì)差異（1）PrPC存在于正常組織及感染動(dòng)物的組織中，是正?；虻漠a(chǎn)物，通常情況下是無(wú)害的，對(duì)蛋白酶K敏感。（2）PrPSC僅存在于感染動(dòng)物的組織中，與致病和傳染有關(guān)，對(duì)蛋白酶K有抗性。這兩種朊蛋白的差異主要是后者β折疊所占比例較前者高。目前認(rèn)為，PrPC轉(zhuǎn)變?yōu)镻rPSC是疾病發(fā)生的基本條件，PrPSC在中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)聚集而導(dǎo)致疾病的發(fā)生[14-18]。

3.2 關(guān)于分子動(dòng)力學(xué)模擬條件選擇 在分子動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中，對(duì)于原子間非共價(jià)鍵靜電相互作用，包括短程靜電相互作用和長(zhǎng)程靜電相互作用兩部分。Cut off算法只計(jì)算體系的短程靜電相互作用不計(jì)算長(zhǎng)程靜電相互作用，體系的波動(dòng)就會(huì)比較劇烈，體系的穩(wěn)定性會(huì)降低。PME是分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算長(zhǎng)程靜電作用的常用計(jì)算方法，通過(guò)計(jì)算體系在分子動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中的長(zhǎng)程靜電相互作用情況，可以更為精確地計(jì)算模擬過(guò)程的勢(shì)能情況，也可以防止體系在模擬過(guò)程中波動(dòng)過(guò)于劇烈[19]。

目前，大量研究表明，人體內(nèi)正常朊蛋白中某些殘基的突變會(huì)導(dǎo)致其二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，從而導(dǎo)致傳染性海綿狀腦病的發(fā)生，但迄今為止，對(duì)其致病機(jī)制尚無(wú)明確結(jié)論。

本研究中采用的分子動(dòng)力學(xué)模擬是近些年來(lái)新興的分子模擬方法，是結(jié)合物理、數(shù)學(xué)和化學(xué)的綜合技術(shù)。分子動(dòng)力學(xué)是一套分子模擬方法，該方法主要是依靠牛頓力學(xué)來(lái)模擬分子體系的運(yùn)動(dòng)，以在由分子體系的不同狀態(tài)構(gòu)成的系綜中抽取樣本，從而計(jì)算體系的構(gòu)型積分，并以構(gòu)型積分的結(jié)果為基礎(chǔ)進(jìn)一步計(jì)算體系的熱力學(xué)量和其他宏觀性質(zhì)。利用分子動(dòng)力學(xué)方法可以從原子水平模擬出蛋白的變構(gòu)過(guò)程，彌補(bǔ)實(shí)驗(yàn)研究的不足。

因此，本研究采用分子動(dòng)力學(xué)的模擬方法，分別對(duì)人野生型和E200K突變型朊蛋白進(jìn)行了10ns分子動(dòng)力學(xué)模擬。結(jié)果表明，E200K的突變會(huì)使朊蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，使朊蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的β折疊長(zhǎng)度增加，使α2和α3螺旋解旋，其解旋的主要原因是由于突變體會(huì)導(dǎo)致α2和α3螺旋骨架氫鍵的穩(wěn)定性下降，這樣β折疊所占的比例就會(huì)升高，α螺旋由于解旋所占比例就會(huì)下降，而這一二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化最終可能會(huì)導(dǎo)致PrPC轉(zhuǎn)化為PrPSC。該研究成果會(huì)為今后傳染性海綿狀腦病致病機(jī)制的研究提供一定的理論依據(jù)。

［1］ 李俊，林東海.朊病毒蛋白的三維結(jié)構(gòu)[J].生命的化學(xué)，2007，27(1)：53

［2］ Zou WQ,Gambetti P.Prion:the chameleon protein[J].Cell Mol Life Sci,2007,64(24):3266

［3］ Mehrpour M,Codogno P.Prion protein:From physiology to cancer biology[J].Cancer Lett,2010,290(1):1

［4］ Sakudo A,Xue G,Kawashita N,et al.Structure of the Prion Protein and its gene:an analysis using bioinformatics and computer simulation[J].Curr Protein Pept Sci,2010,11(2):166

［5］ Martins VR,Beraldo FH,Hajj GN,et al.Prion protein:orchestrating neurotrophic activities[J].Curr Issues Mol Biol,2010,12(2):63

［6］ Pezza JA,Serio TR.Prion propagation:the role of protein dynamics [J].Prion,2007,1(1):36

［7］ van der Kamp MW,Daggett V.The consequences of pathogenic mutations to the human prion protein[J].Protein Eng Des Sel, 2009,22(8):461

［8］ Hasegawa K,Mohri S,Yokoyama T.Fragment molecular orbital calculations reveal that the E200K mutation markedly alters local structural stability in the human prion protein[J].Prion,2010,4(1): 38

［9］ Mancuso M,Siciliano G,Capellari S,et al.Creutzfeldt-Jakob disease with E200K PRNP mutation:a case report and revision of the literature[J].Neurol Sci,2009,30(5):417

［10］Shaw DE.A fast,scalable method for the parallel evaluation of distance-limited pairwise particle interactions[J].J Comput Chem, 2005,26(13):1318

［11］Klepeis JL,Lindorff-Larsen K,Dror RO,et al.Long-timescale molecular dynamics simulations of protein structure and function [J].Curr Opin Struc Biol,2009,19(2):1

［12］Darden T,York D,Pedersen L.Particle mesh ewald:an N.log(N) method for ewald sums in large systems[J].J Chem Phys,1993,98(12):10089

［13］Essmann U,Perera L,Berkowitz ML,et al.A smooth particle mesh ewald potential[J].J Chem Phys,1995,103(19):8577

［14］Nicolas O,Gavin R,del Rio JA.New insights into cellular prion protein(PrPC)functions:The“ying and yang”of a relevant protein [J].Brain Res Rev,2009,61(2):170

［15］Westergard L,Christensen HM,Harris DA.The cellular prion protein (PrPC):Its physiological function and role in disease[J]. Biochim Biophys Acta,2007,1772(6):629

［16］Sakudo A,Ikuta K.Prion protein functions and dysfunction in prion diseases[J].Curr Med Chem,2009,16(3):380

［17］Kupfer L,Hinrichs W,Groschup MH.Prion protein misfolding[J]. Curr Mol Med,2009,9(7):826

［18］Linden R,Martins VR,Prado MAM,et al.Physiology of the prion protein[J].Physiol Rev,2008,88(2):673

［19］El-Bastawissy E,Knaggs MH,Gilbert IH.Molecular dynamics simulations of wild-type and point mutation human prion protein at normal and elevated temperature[J].J Mol Graph Model, 2001,20(2):145