梅景良,吳聰明,程林麗,沈建忠,薛 麒,錢民怡,邵夢瑜

(1.中國農業(yè)大學 動物醫(yī)學院,北京 100193; 2.福建農林大學 動物科學學院,福建 福州350002)

喹乙醇(Olaquindox,OLA)是一種化學合成的廣譜抗菌藥,對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均具有一定的抑制作用,同時對動物具有顯著的促生長作用[1-2]。因此自20世紀70年代起,歐共體、澳大利亞、日本和中國等陸續(xù)批準該藥作為飼料添加劑使用,在畜禽和水產養(yǎng)殖中曾得到廣泛應用[3]。但后來逐漸發(fā)現,喹乙醇具有光敏毒性[4]、致突變和致癌作用[5-8],是一種潛在的基因毒劑[9-11]?；诖?歐盟認為喹乙醇的休藥期不能確定,并對人體健康可能存在不良影響,因此,于 1999年禁止在食品動物生產中使用該藥作促生長添加劑[8,12]。我國于 2000年規(guī)定喹乙醇禁用于禽類和體重超過35 kg的豬,在2005年又規(guī)定禁用于魚類。盡管如此,喹乙醇在我國仍然作為抗菌促生長添加劑被廣泛使用[8]。

由于喹乙醇具有較大危害性,對其進行殘留監(jiān)控是十分必要的。但喹乙醇本身不穩(wěn)定,在動物體內能夠于短時間內被代謝,其代謝產物有十多種,其中 3-甲基-喹噁啉-2-羧酸(methyl-3-quinoxaline-2-carboxylic acid,MQCA)是主要代謝物,在體內相對穩(wěn)定,現已成為國際公認的喹乙醇在可食性動物組織中的殘留標示物[13]。國內外已有較多關于喹乙醇及其代謝物MQCA的殘留檢測方法,如高效液相色譜(HPLC)法、色譜-質譜聯用(LC-MS/MS)、免疫分析法等[14-18]。這些檢測方法有的是針對喹乙醇的原藥殘留的測定,其結果不能體現喹乙醇在動物體內的真實殘留情況,而有的方法雖然是針對 MQCA的檢測,但未測定原藥的殘留量,而且其前處理過程太繁瑣,耗時較長,顯然不利于實際樣品的大規(guī)模檢測[19-21]。更主要的是,由于MQCA既是喹乙醇在動物源食品中的殘留標示物,同時也是喹烯酮等其他喹啉類藥物的殘留標示物[22-23],因此若單純以 MQCA為殘留分析物,即使檢測到陽性樣品,也只能說明陽性樣品曾用過喹啉類藥物,并不能知道用的是這一類藥物中的哪一具體品種。但對水產養(yǎng)殖動物而言,喹乙醇是禁用藥,其他喹啉類藥物為非禁用藥,也就是說,如果想知道這些陽性樣品是否是因使用喹乙醇而導致的 MQCA殘留,就必須再進行一次喹乙醇的殘留檢測才能確定。本項目的研究旨在建立一種能同時檢測魚、蝦中喹乙醇及其代謝物MQCA殘留的HPLC方法,以利于基層質檢機構更有效、更快捷地檢測喹乙醇及其代謝物的殘留。

1 材料與方法

1.1 儀器與試驗材料

Waters2695高效液相色譜儀,配二極管陣列檢測器(美國Waters公司); 離心機; Bond Elut C18固相萃取柱,500 mg,6 mL(美國Varian公司); 組織勻漿機;氮吹儀; 渦旋混合器; 微孔濾膜,0.22 μm。

甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純; 其他試劑均為國產分析純; 水為超純水。

OLA 標準儲備液(100 mg/L)：準確稱取(10±0.01)mg的喹乙醇標準品(純度98.4%,中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所),用甲醇溶解并轉移到棕色容量瓶中定容至100 mL。

MQCA 標準儲備液(100 mg/L)：準確稱取(10±0.01) mg 的 3-甲基-喹啉-2-羧酸標準品(純度94%,德國Dr.Ehrenstorfer公司),用甲醇溶解并轉移到棕色容量瓶中定容至100 mL。

標準工作液：根據使用需要,用甲醇將標準儲備液稀釋成不同濃度的標準工作液,在4℃冰箱中保存,可使用2周。

復溶液：水-0.5%甲酸水-乙腈-甲醇混合溶液(30：40：5：25,V/V)。

供試驗所用的活鯉魚及活對蝦均購自北京某超市,將其可食用部分絞碎勻漿,于-20℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理

將組織樣品從低溫冰箱中取出,室溫解凍。取2.5 g組織至50 mL的離心管中,加入7 mL 0.3 mol/L和1 mL 1mol/L 的HCl溶液,渦旋振蕩提取2 min,3 900 r/min離心10 min,將上清液轉至15 mL尖底塑料離心管中。殘渣加入6 mL 0.3 mol/L HCl溶液再提取1次,將上清液合并至尖底塑料離心管中。上清液以3 900 r/min離心10 min,于冰箱冷藏靜置1 h,最后用C18固相萃取柱凈化。依次用5 mL甲醇和3 mL 0.3 mol/L HCl活化小柱,2 mL超純水淋洗,再依次用3 mL甲醇和1 mL乙腈洗脫至玻璃試管中,于35℃氮氣吹干。最后各組織殘渣用0.5 mL復溶液渦旋振蕩溶解1 min,并于3 900 r/min離心15 min,用0.22 μm濾膜過濾,濾液進行HPLC分析。

1.2.2 HPLC色譜條件

色譜柱：Inertsil? ODS-3 C18 柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),日本 GL Sciences公司產品; 柱溫 30℃; 進樣量 100 μL; 樣品運行時間為 20 min; 雙波長檢測,OLA的檢測波長為 372 nm,MQCA的檢測波長為320 nm; 流動相由純水、乙腈、甲醇和0.5%甲酸水組成,梯度洗脫,具體設定條件見表 1。采用外標法定量。

表1 測定OLA與MQCA的流動相梯度洗脫條件Tab.1 Gradient elution for OLA and MQCA analysis

1.2.3 標準曲線的制備

標準貯備液用復溶液稀釋配制成各含 OLA和MQCA 為 0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 和 1 μg/mL 的系列混合標準溶液,取100 μL按1.2.2項下的 HPLC色譜條件進樣分析。分別以OLA和MQCA的峰面積為縱坐標(Y),OLA和MQCA的質量濃度為橫坐標(X)繪制標準曲線,并求回歸方程和相關系數。

1.2.4 檢測限與定量限的確定

稱取6個空白組織樣品,按1.2.1項下的樣品處理方法進行提取和凈化,同時設 0.02 μg/mL標準工作液作對照,對空白組織樣品和標準工作液進行HPLC分析。計算OLA和MQCA色譜保留時間位置的信噪比,以空白樣品的 3倍信噪比(S/N=3)計算檢測限(limits of detection,LOD),以 10倍信噪比(S/N=10)計算定量限(limits of quantification,LOQ)。

1.2.5 回收率與精密度的測定

取2.5 g(精確至0.01g)空白鯉魚、對蝦組織樣品,鯉魚組織樣品OLA以20、80、200 μg/kg,MQCA以35、100、200 μg/kg; 對蝦組織樣品 OLA 以 15、80、200 μg/kg,MQCA 以 30、100、200 μg/kg 各 3 個濃度,分別進行添加回收試驗,按 1.2.1項下方法處理,在1.2.2項條件下進行 HPLC測定,將峰面積乘以樣品處理中的稀釋倍數,與相應濃度的 3個隨行標準工作液峰面積平均值比較,計算回收率。每個濃度設5個平行,連續(xù)做 3 d,計算日內和日間變異系數即批內和批間相對標準偏差。

2 結果

2.1 方法的線性范圍及檢測限

在本試驗所建立的色譜條件下,OLA和MQCA標準工作液在0.02～1.00 μg/mL濃度范圍內,峰面積(Y)與濃度(X)呈良好的線性關系,其線性回歸方程分別為：Y=266652X-523.88,R=0.9999;Y=181144X-25.76,R=0.9999。

根據 6個空白組織樣品基線噪音值的平均值,按信噪比S/N=3計算LOD,信噪比S/N=10計算LOQ,求的鯉魚肌肉組織中OLA和MQCA的LOD分別為6 和 10 μg/kg,LOQ 分別為 20 和 35 μg/kg; 對蝦組織中OLA和MQCA的LOD分別為4.5和8 μg/kg,LOQ分別為 15和 30 μg/kg。

2.2 藥物的色譜行為

在 1.2.2項色譜條件下測定,色譜峰對稱性好,藥物峰與溶劑峰及基質干擾峰分離較好,可準確測定其峰面積(見圖1～圖4)。且該條件下藥物保留時間的重現性好,以蝦某濃度添加水平為例,OLA及MQCA 的保留時間分別為(4.464±0.009)min和(12.657±0.028)min,變異系數分別僅為 0.20%和0.22%(n=15)。

2.3 回收率和精密度

在空白鯉魚肌肉組織和對蝦組織中分別添加低、中、高3個不同濃度水平OLA和MQCA的標準溶液,按所述方法進行測定,并計算出各加標樣品的回收率,見表 2、表 3。鯉魚肌肉組織中 OLA3個不同添加濃度的平均回收率為 83.5%～87.7%,MQCA 的平均回收率為 79.6%～87.4%; 對蝦肌肉組織中 OLA3個不同添加濃度的平均回收率為74.6%～80.9%,MQCA的平均回收率為81.0%～86.6%,均符合獸藥殘留分析的準確度要求。批內相對標準偏差為 0.51%～4.47%,小于 5%; 批間相對標準偏差為0.66%～7.58%,小于10%,皆符合獸藥殘留分析的精確度要求。

圖1 鯉魚魚肌肉組織中OLA的HPLC色譜圖Fig.1 Liquid chromatograms of OLA in carp muscle tissues

圖2 鯉魚肌肉組織中MQCA的HPLC色譜圖Fig.2 Liquid chromatograms of MQCA in carp muscle tissues

圖3 對蝦肌肉組織中OLA的HPLC色譜圖Fig.3 Liquid chromatograms of OLA in shrimp muscle tissues

圖4 對蝦肌肉組織中MQCA的HPLC色譜圖Fig.4 Liquid chromatograms of MQCA in shrimp muscle tissues

3 討論

3.1 提取與凈化條件的選擇

目前在OLA或MQCA殘留色譜法檢測的樣品制備中,殘留物的提取主要是采用水提取[24-27],偏磷酸甲醇溶液、乙酸乙酯及磷酸鹽緩沖液依次提取[21,28-29],氫氧化鈉溶液水解、乙酸乙酯重復提取[22-23,30],蛋白酶酶解、鹽酸溶液或乙酸乙酯提取[19-20,31],以及用乙腈和乙酸乙酯提取[32]。在本研究中比較了鹽酸溶液、氫氧化鈉溶液、乙酸乙酯等有機溶劑提取,以及這些提取液的不同組合提取,并比較了提取液的用量、用時、溫度、次數和pH值。結果表明,僅采用 0.3 mol/L鹽酸溶液水解即可將OLA及MQCA從鯉魚組織或對蝦組織中同時分離提取出來,且與同等試驗條件下氫氧化鈉溶液水解相比,鹽酸水解可減少提取液中的雜質成分,提高后續(xù)的凈化效果和方法回收率。本文經過對比研究之后尚發(fā)現,若再適當增加提取液的酸性還可提高MQCA的提取效果,因此在初次提取液 7 mL 0.3 mol/L中增加使用了1 mL 1 mol/L鹽酸。

表2 鯉魚肌肉組織中OLA及MQCA的提取回收率與相對標準偏差Tab.2 Recoveries and RSDs of OLA / MQCA in carp muscle tissues

在OLA及MQCA殘留檢測的樣品制備過程中,提取液內殘留物的純化技術基本上是采用固相萃取法,并以使用MAX小柱[20-21,28-29]和SCX小柱[19]為主,但也有的是直接利用液液萃取進行凈化的[22-23,30]。本研究采用的是固相萃取法,并對MAX、MCX、HLB、C18、中性氧化鋁柱等幾種小柱的凈化效果進行了比較,結果發(fā)現 C18小柱可同時較好地保留 OLA和M Q C A。研究中尚對淋洗液和洗脫液的種類及用量進行了大量的篩選和優(yōu)化,結果表明用2 mL超純水淋洗、3 mL甲醇和1 mL乙腈依次洗脫即可達到較好的凈化效果和較高的方法回收率。至于在凈化過程中是否需要采用正己烷進行脫脂這一步驟,可視情況而定,以盡量避免不必要的回收率損失。如蝦肌肉組織的含脂量極低,對檢測基本不存在干擾現象,可不必進行脫脂; 而魚肌肉組織存在一定的含脂量,但其高低與魚的種類和不同季節(jié)有很大的關系,在實際工作中若發(fā)現含脂量較大而干擾正常檢測時,就必須采用適量的正己烷進行脫脂,一般可在氮吹殘渣復溶后用2 mL正己烷脫脂即可獲得滿意的效果。

表3 對蝦肌肉組織中OLA及MQCA的提取回收率與相對標準偏差Tab.3 Recoveries and RSDs of OLA / MQCA in shrimp muscle tissues

3.2 色譜條件的選擇

由于在OLA及MQCA的HPLC法殘留分析中,使用的色譜柱基本上是 C18柱[19-21,28-32],本研究便直接采用色譜性能較好的Inertsil ODS-3 C18柱作為HPLC柱。不過,在不同的研究中所使用的流動相卻存在著很大的差別[19-21,28-30]。經過對比發(fā)現,這些流動相也基本上都是由水相和有機相混合而成,水相一般是純水或低濃度甲酸水,有機相是甲醇、乙腈或二者都有,采用等度或梯度洗脫。因此,在選定色譜柱之后,本研究對以水、甲酸水、甲醇及乙腈組成的不同組合流動相進行了比較,結果表明以 0.1%甲酸水-甲醇-乙腈為流動相時分離效果較好,但 MQCA的峰型較寬,拖尾現象嚴重。又對流動相繼續(xù)進行了優(yōu)化,最后發(fā)現當采用1.2.2項下的流動相進行梯度洗脫時,OLA及MQCA的保留時間和峰型均非常理想,且與干擾峰之間能獲得很好的分離結果。

OLA和MQCA在近紫外光區(qū)有較強的特征吸收峰,但是二者的最大吸收波長不同。為了使OLA和MQCA均能獲得較高的靈敏度,本研究通過DAD全波段掃描(200～400 nm),考察了不同檢測波長對OLA、MQCA測定靈敏度的影響,結果表明,當OLA以372 nm,MQCA以320 nm為檢測波長時,檢測的靈敏度均較高,并且在空白樣品添加測定中能排除其他物質峰的干擾,因而將其作為鯉魚、對蝦組織中OLA和MQCA同步測定的最佳檢測波長。在選定的色譜條件下對鯉魚、對蝦兩種組織中添加的OLA和MQCA進行同步測定,獲得了較為理想的研究結果。

4 結論

采用高效液相色譜法同時檢測鯉魚、對蝦肌肉組織中喹乙醇及其代謝物MQCA殘留,通過稀鹽酸提取,優(yōu)化流動相的配比,可有效分離干擾峰和喹乙醇及其代謝物的色譜峰。本方法可操作性強、重復性好,將有助于基層質檢機構更有效、更快捷地檢測喹乙醇及其代謝物的殘留,以避免含喹乙醇殘留的同類水產品在國內市場流通和進入國際市場。

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