劉鵬超,闕華勇,張國范

(1.中國科學院 海洋研究所,山東 青島 266071; 2.中國科學院研究生院,北京 100049)

貝類胚胎及幼蟲發(fā)育過程中化學物質(zhì)變化研究主要是研究貝類從受精卵到變態(tài)期間各個主要時期胚胎及幼蟲體內(nèi)主要生化組成(脂類、脂肪酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、碳水化合物、核酸)及變化情況,國外已經(jīng)開展了大量的研究[1-5],國內(nèi)關于水產(chǎn)動物早期發(fā)育中生化組成及變化的研究主要集中在魚類和甲殼類[6-10],貝類方面尚未見到詳細報道。

長牡蠣(Crassostrea gigas)隸屬于軟體動物門、雙殼綱、珍珠貝目、牡蠣科,是一種廣溫廣鹽性內(nèi)灣貝類,其肉味鮮美,營養(yǎng)豐富,具有很高的經(jīng)濟價值,是我國主要的牡蠣養(yǎng)殖種類之一,也是世界各國海水養(yǎng)殖業(yè)重要的養(yǎng)殖對象。本文通過對長牡蠣早期胚胎發(fā)育中脂肪酸、氨基酸組成及變化的研究,深化對長牡蠣發(fā)育過程的了解,為長牡蠣早期發(fā)育中營養(yǎng)需求的研究提供基礎資料。

1 材料方法

1.1 實驗材料

本實驗所用性成熟長牡蠣購于福建省漳州市漳浦縣霞美鎮(zhèn),置于實驗室 1立方水槽中自然海水暫養(yǎng),每天換水兩次,換水量為50%,定時投喂小新月菱形藻、金藻等單細胞藻類,輔以螺旋藻粉,每天投喂3次。實驗時,隨機選擇牡蠣解剖,鏡檢,選擇發(fā)育良好的卵子和活力好的精子實施人工授精,受精卵中一部分作為受精后0 h樣品取樣,其余受精卵置于50L水桶中培育,水溫控制在25℃左右,每0.5 h攪拌 1次,微量充氣。分別在受精后 6 h(囊胚),12 h(擔輪幼蟲),24 h(D形幼蟲)用400目篩絹網(wǎng)取樣。使用細胞計數(shù)板統(tǒng)計每毫升水樣中胚胎或幼蟲的數(shù)量以計算樣品中總數(shù)量,所取樣品經(jīng) 6000 r/min離心后,小心吸去上層海水,置于-20℃下冷凍保存。

1.2 測定方法

1.2.1 脂肪酸測定方法

受精后各發(fā)育時期樣品經(jīng)24 h冷凍干燥處理后,參照GB/T 22223-2008的方法測定脂肪酸組成。所用儀器為Agilent 7890A氣相色譜儀,每個時期樣品設兩個重復。

1.2.2 氨基酸測定

經(jīng)24 h冷凍干燥處理的樣品采用PITC(異硫氰酸苯酯)柱前衍生法測定氨基酸含量,所用儀器為alliance 2695高效液相色譜(HPLC),每個樣品設兩個重復。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用單因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)和Tukey’s Post Hoc Tests方法處理和比較相應的數(shù)據(jù)。所用軟件為SPSS(16.0版),文中描述性統(tǒng)計值用平均值±標準誤差表示,顯著性水平設置為a=0.05。

2 結果

2.1 長牡蠣早期胚胎發(fā)育脂肪酸組成變化

長牡蠣受精后0、6、12、24 h等4個發(fā)育節(jié)點脂肪酸組成及變化情況見表1。從脂肪酸組成看,受精卵共檢測到 27種脂肪酸,其中飽和脂肪酸 8種,單不飽和脂肪酸8種,多不飽和脂肪酸 11種。在8種飽和脂肪酸中,碳原子數(shù)目較少的豆蔻酸(14：0)、軟脂酸(16：0)、硬脂酸(18：0)占主導地位,而奇數(shù)碳原子脂肪酸(15：0、17：0)和高碳原子數(shù)目的脂肪酸(20：0、22：0、24：0)含量較少; 在單不飽和脂肪酸中含量最高的是棕櫚油酸(16：1ω7),其他的含量均較低; 11種多不飽和脂肪酸包括5種ω6系列脂肪酸和6種ω3系列 脂 肪 酸,含 量 最 高 的 是 EPA(20：5ω3)和DHA(22：6ω3),亞 油 酸 (18：2ω6)和 花 生 四 烯 酸(20：4ω6)是 ω6 中含量最高的。

飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸占總脂肪酸的比例隨著發(fā)育進行不斷增大,而多不飽和脂肪酸比例逐漸下降。飽和脂肪酸占總脂肪酸比例在24 h發(fā)育中上升了 18%左右; 24 h時單不飽和脂肪比例相對0 h時也有顯著上升(P＜0.05),但是上升比例較小,在2%左右; 多不飽和脂肪酸比例顯著下降(P＜0.05),ω3系列和 ω6系列脂肪酸比例都有不同程度的下降(表 1)。

受精后 0、6、12、24 h 4個節(jié)點∑ω3/∑ω6比值無明顯變化(P＞0.05),但隨著胚胎發(fā)育的進行,∑ω3與∑ω6比值呈減小的趨勢。在長牡蠣24 h早期發(fā)育中,除了 20：4ω3和 DHA,其他 4種 ω3系列脂肪酸含量都顯著降低(P＜0.05),而ω6系列中除20：2ω6在24 h未檢出外,其他4種含量都無明顯變化(P＞0.05,表1）。

DHA/EPA比值在受精后0、6、12 h三個節(jié)點無明顯變化,而在受精后24 h,DHA/EPA比值有所增大,但不顯著(P＞0.05)。在前三個時期DHA與EPA含量相對穩(wěn)定,而在后面的發(fā)育中DHA相對EPA的含量升高(表1)。

2.2 長牡蠣早期胚胎發(fā)育中氨基酸組成變化

在長牡蠣受精后0、6、12、24 h均能檢測到16種氨基酸,包括7中必需氨基酸,7種非必需氨基酸,2種半必需氨基酸,胱氨酸未檢測出(表2)。

總氨基酸含量(%)干質(zhì)量隨著胚胎發(fā)育進行不斷降低,前三個時期變化不明顯,24 h時明顯下降(P＜0.05)。必需氨基酸總和、非必需氨基酸總和、半必需氨基酸總和都隨著胚胎發(fā)育而降低,與總氨基酸含量變化有正相關性。在受精卵中,含量最高的是谷氨酸,其次是精氨酸、賴氨酸、亮氨酸。這4種氨基酸在4個時間點含量都保持較高水平。除苯丙氨酸、蘇氨酸及絲氨酸含量在發(fā)育過程個別階段有不顯著增高外,其他各種氨基酸含量都隨著發(fā)育時間進行而降低(表2)。

3 討論

3.1 脂肪酸組成及其變化

本研究中長牡蠣受精卵中飽和脂肪酸含量高于多不飽和脂肪酸,單不飽和脂肪酸含量最少。在菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)中研究發(fā)現(xiàn)含量最高的同樣為飽和脂肪酸,多不飽和脂肪酸最少[11]。而在加拿大兩種貝類蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)、巨扇貝(Crassadoma gigantea)的研究中發(fā)現(xiàn),兩種貝類卵子中含量最高的均為 EPA,對應的多不飽和脂肪酸含量要高于飽和脂肪酸,單不飽和脂肪酸含量最少[2,12]。不同貝類種類生殖腺或卵子中飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸比例相差很大[2,11-13],不同貝類性腺成熟過程中攝食餌料不同可能是造成這種現(xiàn)象的一個重要原因。此外我們發(fā)現(xiàn),多不飽和脂肪酸高于飽和脂肪酸的幾種貝類多為冷水性貝類或是產(chǎn)卵溫度較低的貝類,而產(chǎn)卵溫度較高的貝類其卵子中飽和脂肪酸含量一般較高。多不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸重要的區(qū)別是其熔點較低,可見產(chǎn)卵溫度較低對應較低熔點的脂肪酸,而產(chǎn)卵溫度相對高的貝類卵子中脂肪酸熔點亦較高,這可能與脂肪酸在維持細胞膜的流動性與滲透性中起重要作用相關聯(lián); 另外,多不飽和脂肪酸含量高的貝類中 EPA含量較高,而無論是哪種貝類,早期發(fā)育中 EPA都大量消耗,這說明產(chǎn)卵溫度較低的貝類受精卵發(fā)育時可能消耗更多的 EPA,考慮 EPA在發(fā)育中的作用,這些貝類受精卵發(fā)育時可能需要更高的能量,這也與其發(fā)育時環(huán)境溫度較低相對應。

在長牡蠣早期胚胎發(fā)育中飽和脂肪酸占總脂肪酸和單不飽和脂肪酸比例不斷上升,而多不飽和脂肪酸比例下降,這種現(xiàn)象在前面提到的菲律賓蛤仔、蝦夷扇貝、巨扇貝中也出現(xiàn)[3,12-13]。無論起始受精卵中飽和脂肪酸含量是否高于多不飽和脂肪酸,三類脂肪酸總和在這幾種貝類中增高或降低趨勢是相同的,只是增高或下降的程度有所不同。這可能與不同脂肪酸在胚胎發(fā)育中的功能有關,多不飽和脂肪酸比例下降主要是EPA含量下降,而EPA在胚胎發(fā)育中作為能源消耗,這可能是導致三類脂肪酸比例變化的一個重要原因。

表1 長牡蠣受精后不同時間脂肪酸組成(% 總脂肪酸)變化Tab.1 Variations of fatty acids (% Total fatty acids) of Pacific oyster (Crassostrea gigas) at different times postfertilization

長牡蠣從受精卵發(fā)育到 D形幼蟲,∑ω3與∑ω6比值呈減小的趨勢,ω3系列中部分脂肪酸相對于ω6系列脂肪酸更快的消耗。Pernet等[14]研究發(fā)現(xiàn)在深海扇貝(Placopecten magellanicus)隨著幼蟲發(fā)育其∑ω6與∑ω3比值會增大,認為貝類幼蟲會選擇性地整合或保持 ω6系列脂肪酸,而 ω3系列脂肪酸會被選擇性地消耗利用。而在珍珠貝(Pinctada margaritifera)產(chǎn)出的卵子中∑ω3與∑ω6比值顯著小于生殖腺中卵子各發(fā)育時期[15],∑ω3與∑ω6比值的這種變化可能從卵母細胞發(fā)育就開始,具有一定的連續(xù)性。

表2 長牡蠣受精后不同時間氨基酸組成(% 干質(zhì)量)Tab.2 Amino acid composition of Pacific oyster (Crassostrea gigas)at different times post-fertilization.

長牡蠣早期胚胎發(fā)育中 DHA/EPA比值不斷變化,總體上呈上升趨勢。雖然DHA和EPA含量都在下降,但是EPA消耗更迅速一些。在以前的研究中,很多學者就發(fā)現(xiàn) EPA和DHA在雙殼貝類發(fā)育中有非常重要的作用,大多數(shù)雙殼貝類自身不能合成EPA和DHA。在早期發(fā)育中EPA更多的作為能源消耗,而 DHA主要作為一種結構物質(zhì),起構建作用。在 Whyte等[3]對巨扇貝的研究中,在 72 h發(fā)育中DHA含量基本無變化,這與本實驗結果有一定差別,但是兩項實驗結果中 EPA含量都明顯降低,都表明DHA相對EPA含量升高。

3.2 氨基酸的含量變化

氨基酸總含量(%干質(zhì)量)呈下降趨勢,到受精后24 h的D形幼蟲時期顯著降低,但是仍然保持較高水平(占干質(zhì)量的22%左右)。在所檢測的必需氨基酸中,賴氨酸Lys與亮氨酸Leu含量最高,并且在受精后四個時間都保持較高的含量。生物體的代謝中,Leu可分解成乙酰COA和乙酰乙酸,而兩者均是溝通糖類與脂類代謝的重要中間物質(zhì)。在非必需氨基酸中谷氨酸Glu含量最高,可能有兩方面的原因,一是海水貝類為排氨動物,早期胚胎或幼蟲代謝產(chǎn)生的氨需與 Glu結合形成相應的谷氨酰胺,經(jīng)酶分解成游離的氨排出體外; 另外谷氨酸在酶的催化下,可生成相應的α—酮戊二酸,而α—酮戊二酸又是三梭酸循環(huán)中關鍵的中間代謝產(chǎn)物,在胚胎發(fā)育時期谷氨酸對糖、脂、蛋白質(zhì)的代謝及相互轉化有重要意義。

致謝：特別感謝福建省水產(chǎn)研究所曾志南、寧岳老師在長牡蠣親貝材料方面的支持,感謝實驗室杜潤山老師、劉磊同學在幼蟲培育中對我的指導和幫助。

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