田瀟娜， 劉國紅， 劉 波， 林營志

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物資源研究所, 福建 福州 350003； 2.福建農(nóng)林大學生命科學學院， 福建 福州 350002)

芽胞桿菌(Bacillus)是一種革蘭氏陽性菌，能夠產(chǎn)生對熱、紫外線、電磁輻射和某些化學藥品具有強抗性的芽胞，能在多種不良環(huán)境下存活，分化形成具有特殊功能的菌株。因此，芽胞桿菌在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學、科學領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用，為了更高效地利用芽胞桿菌資源，對芽胞桿菌系統(tǒng)學進行研究，對其分類鑒定方法進行改進就非常必要。

自20世紀90年代以來，分子生物學方法在芽胞桿菌的分類鑒定中得到廣泛應(yīng)用，如DNA-DNA雜交同源性分析、G+C含量分析、16S rRNA序列分析等。16S rRNA因進化速率緩慢，基因產(chǎn)物功能保守，其序列分析是目前細菌的主要系統(tǒng)發(fā)育分類方法。但16S rRNA分子較小、包含的信息量也較少，對于親緣關(guān)系較近的細菌一般分辨率較低，存在一定的局限性，只能大概在屬的水平上區(qū)分細菌，種水平的分類單元一般通過DNA-DNA雜交來鑒定。但DNA-DNA雜交不僅操作復雜，而且操作過程受很多因素影響，因此雜交結(jié)果不穩(wěn)定。隨著科學技術(shù)的發(fā)展，利用系統(tǒng)發(fā)育標記基因進行芽胞桿菌的鑒定越來越多，即以進化速率不同的分子為研究對象，進行芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。近年來，不斷有新的分子標記基因被發(fā)現(xiàn)并使用。分子標記基因可以反映生物個體或種群基因組中某種特異性DNA片段的差異，一般所選擇的靶基因主要分為2類，即非蛋白編碼基因與蛋白編碼基因，作為分子標記應(yīng)具備的條件[1]為：基因普遍存在于各種細菌；對于特殊的生長條件不顯示適應(yīng)性突變；不發(fā)生水平轉(zhuǎn)移。目前，使用最廣泛的非蛋白編碼基因為16S rRNA基因序列分析，一般可以對親緣關(guān)系較遠的菌株進行鑒定。蛋白編碼基因，可以同時從氨基酸和核酸水平2個信息系統(tǒng)進行分析。如熱激蛋白(HSP)相關(guān)基因(hsp65、hsp70等)、重組蛋白基因(recA等)、延長因子Tu基因、部分RNA聚合酶基因(rpoB、rpoD等)和DNA拓撲異構(gòu)酶II的gyrB[2]等，對親緣關(guān)系較近的菌株的鑒定顯示了較大的優(yōu)越性。筆者主要闡述近年來使用較多的分子標記基因gyrB、rpoB、gyrA等基因在芽胞桿菌分類鑒定中的應(yīng)用。

1 gyrB基因

1.1 gyrB基因的編碼蛋白及其功能

gyrB基因即促旋酶(gyrase)B亞單位基因，大小為2 kb的單拷貝持家基因，該基因高度保守，進化較快，平均每5000萬年單核苷酸堿基對變化1次。細菌DNA促旋酶由2種亞單位組成[3]，A亞基(gyrA)和B亞基(gyrB)，酶的活性結(jié)構(gòu)是2個A亞基和2個B亞基組成的四聚體，目前還沒發(fā)現(xiàn)兩者之間有連接體。其中B亞基是由gyrB基因編碼，分子量約90或70 kDa，具有DNA依賴的ATP酶活性，催化ATP的水解。DNA促旋酶屬于信息通路中與DNA復制、限制、修飾或修復有關(guān)的編碼蛋白。在大多數(shù)細菌中，以單拷貝的形式存在細菌基因組中，編碼的是唯一一種能誘導DNA負超螺旋的拓撲異構(gòu)酶-DNA促旋酶的B亞單位蛋白gyrB。它是一種細菌Ⅱ型拓撲異構(gòu)酶，在DNA復制及DNA超螺旋結(jié)構(gòu)的維持過程中起著重要的作用。

1.2 gyrB基因在芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育分析中的應(yīng)用

gyrB基因是目前細菌分類鑒定中系統(tǒng)發(fā)育標記的典型代表。自從首次設(shè)計出通用引物并從許多革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌中成功擴增出gyrB基因后，由于gyrB基因不顯現(xiàn)頻繁的基因橫行轉(zhuǎn)移，并且基于該基因的序列分析與DNA-DNA雜交的同源性分析有較好的一致性，gyrB基因在芽胞桿菌的系統(tǒng)發(fā)育分析及菌株鑒定中被廣泛使用，一般研究對該基因進行測序或?qū)ζ銹CR產(chǎn)物進行RFLP分析。gyrB基因的進化和細菌間的分子起源：分子系統(tǒng)研究的模式分子通過構(gòu)建gyrB和16S rRNA基因的系統(tǒng)進化樹展示了細菌間的進化關(guān)系，證明了基于gyrB基因的進化樹在決定沙雷氏菌之間的系統(tǒng)進化中比16S rRNA更可靠，16S rRNA在描述遠源細菌間的關(guān)系中比較有用，而gyrB基因在細菌分子間和分子內(nèi)的系統(tǒng)分析中更具有參考價值。在枯草芽胞桿菌組的鑒定中[4]，通過對同組芽胞桿菌的16S rRNA序列及gyrB基因和DNA-DNA雜交基因的序列相似性進行比較，gyrB基因的相似性與16S rRNA序列相比較低，而和DNA-DNA雜交有較好的一致性，可見gyrB基因可以作為枯草芽胞桿菌的有效地分類鑒定的方法。為了鑒定食物中的菌[5]，利用PCR技術(shù)結(jié)合限制性內(nèi)切酶技術(shù)，所選芽胞桿菌用Genebank中的引物對gyrB基因進行PCR擴增，用RsaI，Sau3AI和EcoRI等限制性內(nèi)切酶消化，論證了用gyrB基因特異性序列鑒別食物中蠟狀芽胞桿菌組的可能性。gyrB基因的PCR-Sau3AI指紋圖譜[6]也可以鑒定蘇云金芽胞桿菌，正如Yamada et al[7]報道的它避免了使用3種特殊的引物進行菌株的鑒定。

基于gyrB基因的數(shù)據(jù)庫ICB[8]，為gyrB基因作為進化和分類標記提供了參考點和研究平臺。不僅包括菌株的核苷酸和氨基酸信息，可以進行不同分類水平的序列比對，還提供菌株鑒定的引物選擇和背景信息。Bavykin et al[9]利用16S rRNA、23S rRNA和gyrB基因序列研究了蠟狀芽胞桿菌組的進化關(guān)系，對蠟狀芽胞桿菌組183株和74株菌分別進行了16S rRNA和23S rRNA序列分析，并對30株經(jīng)過16S rRNA鑒定的該組菌進行g(shù)yrB序列分析，結(jié)果蠟狀芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌3種基因序列分析都表現(xiàn)出異質(zhì)性，而炭疽芽胞桿菌表現(xiàn)出同源性，證明了gyrB基因序列分析可以把炭疽芽胞桿菌從蠟狀芽胞桿菌組中分離出來。Soufiane et al[11]在鑒定H血清型蘇云金芽胞桿菌時對16S rRNA，gyrB和aroE基因序列分析，3種基因都可以鑒定H血清型蘇云金芽胞桿菌，而gyrB和aroE基因顯示了極大的優(yōu)勢，但gyrB基因可以作為從H血清型蘇云金芽胞桿菌和同一血清型蘇云金芽胞桿菌中鑒定菌株的最佳標記基因。基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜[11]作為一種蛋白分析鑒定細菌的工具，在短小芽胞桿菌的鑒定中對其功能的驗證不僅利用16S rRNA基因進行鑒定，更進一步用gyrB基因進行了鑒定。在鑒定新月紅色進口火蟻中的芽胞桿菌時[12]gyrB基因與GenBank基因序列相比達到了95.48%到100%的匹配值，由此可見在芽胞桿菌鑒定中g(shù)yrB基因的使用是很廣泛的。

1.3 gyrA基因在芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育分析中的應(yīng)用

gyrA即促旋酶(gyrase)的A亞單位基因，它和DNA促旋酶gyrB基因相連。A亞基由gyrA編碼，分子量約100 kDa，具有磷酸二酯酶活性，負責DNA斷裂和重接。由于其具有與gyrB基因類似的結(jié)構(gòu)和功能，因此可以作為菌株系統(tǒng)發(fā)育標記。中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection， CICC)采用gyrA基因序列分析技術(shù)，對其保存的36株枯草芽胞桿菌菌群進行系統(tǒng)發(fā)育分析，得到與16S rRNA基因序列分析一致的拓撲結(jié)構(gòu)系統(tǒng)發(fā)育樹，位于3個不同的系統(tǒng)發(fā)育分支間菌株的gyrA基因序列相似度在75.3%-95.3%之間，遠低于16S rRNA基因序列相似度。gyrA基因序列分析對枯草芽胞桿菌群菌種的分辨率高于16S rRNA基因充分顯示了該基因用來鑒定芽胞桿菌的優(yōu)勢，因此有望成為工業(yè)用枯草芽胞桿菌菌種鑒定的一個有力工具。gyrA基因在其他相關(guān)芽胞桿菌的鑒定中也顯示了相對16S rRNA序列分析的優(yōu)勢及DNA-DNA雜交的一致性。

2 rpoB基因

2.1 rpoB基因的編碼蛋白及其功能

rpoB基因，編碼RNA聚合酶的β亞單位，被作為菌株鑒定和系統(tǒng)進化的標記?；趓poB基因的RT-PCR[13-14]已被用作鑒定蠟狀芽胞桿菌和巨大芽胞桿菌，尤其在鑒別蠟狀芽胞桿菌組的炭疽芽胞桿菌中使用較多。部分rpoB基因序列，位于進行RT-PCR的下游區(qū)域，它包括一段利福平耐藥性區(qū)段[15-16]，可以進行炭疽、蠟狀、蘇云金、蕈狀和巨大芽胞桿菌等的基因型比較分析。韓國學者Ko et al[17]對炭疽芽胞桿菌及其近緣種蠟狀芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌的rpoB基因進行了序列比較分析，系統(tǒng)進化分析表明炭疽芽胞桿菌分為單獨的一支，因此認為rpoB基因可作為毒性炭疽芽胞桿菌的有效快速的鑒定方法。明膠產(chǎn)品的污染是目前備受人們關(guān)注的問題，產(chǎn)品經(jīng)過高溫處理后仍存在細菌污染，Clerck et al[18]從明膠半成品提取物中分離到1129株菌，通過16S rDNA進行初步篩選，再通過gyrA和rpoB序列的rep-PCR技術(shù)進行鑒定，大多數(shù)菌株被鑒定為芽胞桿菌菌株。多項研究[19-20]均充分驗證了rpoB基因在枯草芽胞桿菌組及其相關(guān)菌株的鑒定中是非常有效的。

2.2 rpoB基因在芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育分析中的應(yīng)用

2000年[21]基于rpoB基因的微生物群落分析就表明16S rDNA在種內(nèi)鑒定存在局限性。如今rpoB基因在醫(yī)學、臨床診斷和生態(tài)研究、環(huán)境監(jiān)測等方面已被廣泛使用，一般結(jié)合限制性片段長度多態(tài)性和多項分析進行研究。臨床上[22]使用rpoB基因檢測炭疽芽胞桿菌，根據(jù)復合探針熒光定量分析原理，以炭疽芽胞桿菌染色體上的rpoB基因為靶序列，設(shè)計合成引物和探針，進行實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測，該法檢測炭疽芽胞桿菌的靈敏度很高，能特異區(qū)分炭疽芽胞桿菌與其他蠟樣芽胞桿菌。rpoB基因[23]代替16S rDNA用來鑒定固氮類芽胞桿菌，可以結(jié)合多重PCR等技術(shù)把炭疽芽胞桿菌從蠟狀芽胞桿菌中分離出來。Meintanis et al[24]運用REP-PCR和BOX-PCR技術(shù)對Geobacillus屬菌株及芽胞桿菌模式菌株的rpoB基因序列進行了相似性分析，進化樹分析表明rpoB基因序列相似性遠低于16S rDNA序列相似性，因此，基于rpoB基因的REP-PCR和BOX-PCR技術(shù)可以進行Geobacillus屬的分子分型，rpoB基因是Geobacillus屬優(yōu)于16S rDNA的準確有效的鑒定方法。Ki et al[25]則將20株分離自海洋環(huán)境的芽胞桿菌通過16S rDNA序列比較,分為13個基因型和9個種，而基于rpoB基因的進化樹是16S rDNA的4.5倍，說明rpoB的基因多態(tài)性可以作為芽胞桿菌鑒定的標記。為了克服16S rDNA 鑒定Geobacillus屬菌株的局限性，Weng et al[26]也通過recA和rpoB基因序列比較對Geobacillus屬菌株進行了進化分析和分子鑒定，rpoB基因序列分型顯示了更高的一致性，以此可以作為Geobacillus屬高效便捷的鑒定方法。

3 rpoD基因

枯草芽胞桿菌RNA聚合酶至少以5種聚合酶的形式存在[27]，尤其是在細胞內(nèi)每種酶對應(yīng)1種σ因子作為特異性啟動子。RNA聚合酶的主要形式為43 000 Da的σ因子，是由rpoD基因編碼的，與大腸桿菌RNA聚合酶的主要σ因子同源?？莶菅堪麠U菌聚合酶σ43包括3個基因：P23，dnaE和rpoD(σ43)，3個基因緊密的連在一起。在細菌生長的不同時期，2個重疊σ43啟動子控制操縱子的表達，而σ37啟動子在孢子形成時期調(diào)節(jié)操縱子的表達。rpoD基因處于aroD和lys基因之間，與dnaE基因相連，屬于crsA基因的一部分，其基因序列為acf-aroD-dnaE-rpoD(crsA)-spoOG-lys。rpoD基因的上游編碼區(qū)為dnaE基因，它編碼62 000 Da的蛋白，該蛋白對DNA復制是非常重要的，并且2個基因在染色體上為同方向逆時針轉(zhuǎn)錄，因此，rpoD基因的功能和結(jié)構(gòu)與大腸桿菌的操縱子相似[28]。研究表明基于氨基酸序列合成的核酸探針在大腸桿菌和枯草芽胞桿菌中主要σ因子的合成中是非常保守的，可以用來鑒定不同真細菌的rpoD同源基因。在大腸桿菌和枯草芽胞桿菌的假定編碼區(qū)和主要的σ因子區(qū)有13個氨基酸序列是非常普遍的，可以作為σ因子和主要σ因子的特征。這些基因被命名為hrdA，hrdB，hrdC和hrdD。據(jù)此設(shè)計的探針在檢測各種真細菌rpoD基因的同源性時顯示了很好的雜交信號?？梢妑poD基因也是比較保守的，它特殊的結(jié)構(gòu)和功能決定了rpoD基因可以作為系統(tǒng)發(fā)育標記。rpoD基因在芽胞桿菌鑒定中應(yīng)用較少，Matsuura et al[29]在鑒定Erwiniaamylovora時對16S rRNA，gyrB和rpoD基因等分子標記進行了分析，證明了rpoD基因在細菌鑒定中的優(yōu)勢。

4 cry基因

蘇云金芽胞桿菌(Bt)制劑是目前國內(nèi)外應(yīng)用最廣泛的微生物殺蟲劑，其殺蟲的主要活性成分是由殺蟲蛋白基因(cry基因)編碼，并于營養(yǎng)期或芽胞形成期產(chǎn)生的殺蟲晶體蛋白(ICPs)。根據(jù)Crickmore et al[30]確立的新的分類規(guī)則，它們分別被確立為53個群、169類、386個亞類殺蟲蛋白基因，因此cry基因家族成為蘇云金芽胞桿菌鑒定的金標準。趙銀娟等[31]從連云港海域中篩選出1株較有潛力的高活性Bt菌株，對其生物學特性進行了研究，同時也用cry基因證實了該菌的特殊性?？莶菅堪麠U菌、地衣芽胞桿菌、巨大芽胞桿菌、短小芽胞桿菌和環(huán)狀芽胞桿菌是5種環(huán)保微生物制劑中常用的芽胞桿菌，針對這些菌的傳統(tǒng)理化檢測方法費時費力，程琳琳等[32]建立了一種快速、準確的檢測方法，不僅使用GenBank上已有g(shù)yrB基因序列分別設(shè)計和篩選上述菌種的特異性引物，還利用rpoB、gdh系統(tǒng)發(fā)育標記經(jīng)優(yōu)化建立了PCR快速有效檢測方法。炭疽芽胞桿菌含有毒性質(zhì)?；騪XO2，可以使細菌產(chǎn)生莢膜，pXO2上的cap基因在鑒定炭疽芽胞桿菌中已被使用，陳蘇紅等[33]為建立一種簡便的炭疽芽胞桿菌檢測方法作臨床診斷工具，以pXO1質(zhì)粒上的pag基因及pXO2上的cap基因為靶標合成特異引物，進行定量PCR擴增來檢測目的產(chǎn)物，該法檢測炭疽的靈敏度很高，并且能區(qū)分炭疽芽胞桿菌與其它蠟樣芽胞桿菌。parE基因[34]為拓撲異構(gòu)酶IV的編碼基因，可以對嗜熱菌Geobacillus屬的菌株進行鑒定，作為管家基因在地衣芽胞桿菌組的鑒定中也被用作標記基因。Hua et al[35]在16S rRNA鑒定的基礎(chǔ)上通過管家基因gyrB和parE分別驗證了日本和敦煌2個地區(qū)枯草芽胞桿菌和地衣芽胞桿菌的同源性，證明了東亞北部黃土轉(zhuǎn)運微生物事件。

5 討論

基因的系統(tǒng)發(fā)育分析在細菌分類鑒定中占有重要地位。隨著分子生物學和測序技術(shù)的發(fā)展，DNA大規(guī)模測序得以進行，傳統(tǒng)鑒定細菌的方法，在某些方面被一種可定量、較精確的以可翻譯核苷酸序列為基礎(chǔ)的分析方法所取代。因此，以核苷酸序列為基礎(chǔ)的分析，要求選擇合適的靶基因進行比較分析。適合于系統(tǒng)發(fā)育研究的保守基因在其進化過程中都面臨著巨大的選擇壓力，非編碼蛋白基因如16S rRNA基因與蛋白編碼基因相比，不同之處是在進化過程中受到不同的約束條件，蛋白編碼基因由于密碼子的簡并性，具有更大的變化，在細菌的鑒定中提供了更精確的信息，因此，在菌株分類鑒定中已被頻繁利用，gyrB、rpoB、gyrA和parE等基因在不同種芽胞桿菌的鑒定中各有優(yōu)勢?；诨蛐蛄袠擞浀难堪麠U菌系統(tǒng)發(fā)育分析等研究目前已廣泛展開，但是，要想獲得更精確的分子標記仍然需要不斷的研究和探索。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，細菌基因序列的分析和比對逐漸變得較為容易，因此應(yīng)用分子標記基因進行系統(tǒng)發(fā)育分類將不斷深入研究。

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