彭伶俐，王琴，辛明秀

(北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京100875)

環(huán)境中存在的微生物估計達(dá)到105～106種，但在實驗室培養(yǎng)基中可分離鑒定的種類數(shù)量較少。國際原核生物分類學(xué)委員會證實:自從平板培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用以來，發(fā)現(xiàn)的原核種類只有7 031種［1］。這種差別可能是由于許多微生物的不同生長狀態(tài)比如休眠期不能根據(jù)培養(yǎng)基成分的變化及時調(diào)整自身生長，導(dǎo)致在平板中無法計數(shù)［2］。放射自顯影技術(shù)及直接活菌計數(shù)都表明平板中50%甚至90%的細(xì)菌細(xì)胞保持代謝活性［3］，但卻不能在固體培養(yǎng)基上形成菌落，從表觀上認(rèn)為這類微生物是不可培養(yǎng)的微生物。不可培養(yǎng)微生物是一個巨大的微生物資源庫，其中蘊藏著豐富的新基因。對其進(jìn)行深入研究可充分認(rèn)識微生物物種的多樣性，了解生物進(jìn)化及微生物系統(tǒng)發(fā)育學(xué)信息。研究不可培養(yǎng)微生物的代謝多樣性可發(fā)現(xiàn)新的代謝途徑和新的代謝產(chǎn)物。不可培養(yǎng)微生物的研究開拓了微生物學(xué)研究的新領(lǐng)域，不僅在基礎(chǔ)生物學(xué)研究中具有意義，同時發(fā)現(xiàn)新的物種、新的基因和新的代謝產(chǎn)物，將對發(fā)現(xiàn)新化合物特別是新藥開發(fā)具有積極意義。

1 微生物不可培養(yǎng)的原因及限制因子

1.1 部分微生物生長緩慢，尚沒有敏感檢測技術(shù)

自然環(huán)境中許多微生物都聚集生長，適合實驗室培養(yǎng)條件下生長的微生物快速繁殖，大量攝取了培養(yǎng)基中有限的營養(yǎng)成分，從而使生長緩慢的微生物得不到充足的營養(yǎng)使生長受到抑制;某些微生物即使能夠在低濃度營養(yǎng)條件下生長，但在特定的培養(yǎng)條件下不能長成肉眼可見的菌落;還有一類生存在寡營養(yǎng)環(huán)境下的微生物在平板培養(yǎng)基中不形成菌落，而是在表面擴(kuò)散生長，僅形成幾個細(xì)胞組成的小型集合;此外，衡量微生物生長狀況的常規(guī)方法比如比濁法和計數(shù)法等都不能檢測到這些微生物，表觀上被認(rèn)為“不可培養(yǎng)”?，F(xiàn)在比較成熟的是用微毛細(xì)管或光學(xué)鑷子進(jìn)行的單細(xì)胞分離技術(shù)，這種方法可以從微生物群落中鑒定出目的細(xì)胞［4］。這種技術(shù)需要嚴(yán)格的實驗條件，同時由于對目的細(xì)胞的代謝認(rèn)識不足，以致于無法掌握適宜它們生長的決定因子。另一方面，由于缺乏清晰直接的形態(tài)學(xué)特征也很難在一個復(fù)雜的微生物群體中鑒定出需要的目的細(xì)胞。分子生態(tài)學(xué)和宏基因組學(xué)顯著增加了對遺傳多樣性的認(rèn)識，但這些技術(shù)并不能完全檢測編碼微生物生命的整個遺傳多樣性的內(nèi)容［5］。

1.2 培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分相對比較豐富

自然界中可以利用高濃度營養(yǎng)物質(zhì)的微生物很少，大多數(shù)微生物處于“貧營養(yǎng)”生長狀態(tài)。實驗室中通常將需要貧營養(yǎng)的微生物置于豐富的營養(yǎng)環(huán)境中，微生物早期會快速生長，但同時產(chǎn)生大量的、微生物自身難以調(diào)節(jié)的過氧化物、超氧化物或羥基自由基等“毒性氧物質(zhì)”，該類物質(zhì)快速、過量的積累會破壞微生物細(xì)胞的內(nèi)膜結(jié)構(gòu)，由此產(chǎn)生一些應(yīng)激機(jī)制如SOS來修復(fù)微生物［6］，未及時修復(fù)的微生物將會死亡或表現(xiàn)為不可培養(yǎng)。

1.3 忽視了環(huán)境中微生物之間的相互作用

自然環(huán)境中微生物之間的相互關(guān)系非常復(fù)雜。共生是至少有一個群體為另一個群體提供其必需的生長因子從而使微生物群體獲利。當(dāng)它們之間的距離靠近，本來不能生長的微生物得到另一類微生物提供的生長因子變得可以生長，而當(dāng)微生物之間距離較遠(yuǎn)或不存在時則互不干擾或者干擾程度較低導(dǎo)致這些微生物不可培養(yǎng)［6］。另一種關(guān)系是群體感應(yīng)。它是微生物間通過感應(yīng)一種信號分子來判斷群體密度和環(huán)境的變化，啟動相應(yīng)的基因作出協(xié)調(diào)統(tǒng)一的應(yīng)答，從而調(diào)節(jié)群體的生長。當(dāng)微生物的群體密度較低時，自身誘導(dǎo)素合酶基因產(chǎn)生一個基礎(chǔ)水平表達(dá)，引起自身誘導(dǎo)信號產(chǎn)生，這些信號在細(xì)胞外擴(kuò)散并且立即在周圍環(huán)境中被稀釋。而群體密度不斷上升，引起自身誘導(dǎo)素在細(xì)胞周圍不斷積累，激活特定的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白抑制它的活性，致使微生物其他表型的活化［7-8］。微生物之間還存在其他類型的關(guān)系，在實驗室培養(yǎng)條件下，單純地將待培養(yǎng)的微生物與其他相關(guān)的微生物群體分開，物種之間的信息交流被阻斷，微生物因缺乏必需的生長因子和信號分子而無法生長，表現(xiàn)為不可培養(yǎng)。

1.4 缺乏足夠的認(rèn)識，在實驗室條件下無法實現(xiàn)原位培養(yǎng)

微生物的生存環(huán)境和自然條件相當(dāng)復(fù)雜，比如:微生物的多樣性、自然環(huán)境中的化學(xué)因素、環(huán)境中生物與非生物因素之間的相互作用以及微生物水平上的全球生態(tài)系統(tǒng)的平衡等。因此，沒有或無法完全模擬微生物的自然生存條件，而通常只是將培養(yǎng)條件進(jìn)行改善，如將微生物置于恒溫、恒定轉(zhuǎn)速、黑暗的環(huán)境中;將微生物限制在固體培養(yǎng)基或不攪動的液體介質(zhì)中;替換微生物的營養(yǎng)組分或者缺少某種化學(xué)因子等。對微生物培養(yǎng)條件的認(rèn)識需要逐漸探索，如在培養(yǎng)Spirochaetes(螺旋體)的培養(yǎng)基中一直添加能夠使固氮酶失活的微量鎢元素［9］，然而最近發(fā)現(xiàn)它也能夠在鎢缺少的培養(yǎng)基中通過固氮的方式生長。此外，自然界中大部分微生物以群體的形式生長來交換中間代謝產(chǎn)物和信號分子，因此在實驗室中無法模擬原位生長的群體培養(yǎng)。

2 改善不可培養(yǎng)微生物可培養(yǎng)效率的方法

2.1 分散群體微生物

一種方法是在固體培養(yǎng)基上重復(fù)劃線，目的是將微生物從群落中分離出來;另一種是在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行一系列重復(fù)的稀釋來分離細(xì)胞。通過這些方法已經(jīng)純培養(yǎng)出許多種類微生物，而這些種類所屬的門類沒有或者只有很少代表物種［10］。然而用這些分離方法培養(yǎng)出的種類一般是生長迅速的微生物。

2.2 常規(guī)培養(yǎng)方法的改進(jìn)

2.2.1 培養(yǎng)基的改善①添加非傳統(tǒng)的碳源、電子供體與受體:2001年Uphoff等［11］將北海的海水樣品在添加了多種不同碳源和復(fù)雜化合物的培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)，它比僅含有一種碳源培養(yǎng)基上生長的微生物種類和數(shù)量都多。單一碳源分離的菌種幾乎完全屬于變形菌，而在復(fù)合的培養(yǎng)基上則分離到4種其他門類的代表物種。2005年Kopke等［12］在培養(yǎng)基中加入多樣的電子受體和碳源從地下煤沉淀物中分離出新種類的微生物。最近，由特殊的原核生物生態(tài)群落催化的新還原產(chǎn)物也被用于豐富傳統(tǒng)培養(yǎng)基的類型，并且發(fā)現(xiàn)了新的種類［13］;②采用低濃度營養(yǎng)成分培養(yǎng)基或者加入具有毒性氧降解能力的物質(zhì):高濃度營養(yǎng)成分的培養(yǎng)方法由于產(chǎn)生毒性氧物質(zhì)導(dǎo)致所培養(yǎng)的微生物數(shù)量和種類都減少，Aagot［14］發(fā)現(xiàn)在低濃度營養(yǎng)基質(zhì)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的微生物較多，但是營養(yǎng)成分濃度過低也使微生物數(shù)量下降［4］。減少毒性氧物質(zhì)的產(chǎn)生也是提高微生物可培養(yǎng)性的一個有利方法。增加多聚物作為碳源，因為多聚物只有被分解成小分子物質(zhì)才能被利用，這樣微生物在短時間內(nèi)不會受到毒害作用，有效地減緩了受毒害的速度［5］。減少培養(yǎng)環(huán)境中的氧分壓也可以減弱由充足的氧氣而導(dǎo)致毒性氧的傷害［8］。同時，在培養(yǎng)過程中添加過氧化氫酶、丙酮酸鈉、α-酮戊二酸、二硫代二丙酸等具有毒性氧降解能力的物質(zhì)也可以大大提高微生物可培養(yǎng)性［9-11］;③增加信號分子來維持微生物之間的相互作用:氮酰高絲氨酸內(nèi)酯可以有效地提高微生物可培養(yǎng)性［4-6］，基于這個發(fā)現(xiàn)，用于多種基因調(diào)控的信號分子cAMP相對于氮酰高絲氨酸內(nèi)酯更能夠促使微生物的生長，提高了微生物的可培養(yǎng)性［14］。有些細(xì)菌例如藤黃微球菌可以分泌一種促進(jìn)復(fù)活因子能夠有效地恢復(fù)處于休眠期的革蘭陽性菌的活性［15］;④添加酶、抑制細(xì)菌生長的抗生素或者其他抑制劑:添加酶來培養(yǎng)一些產(chǎn)生活性氧的物種［16］，添加某種抑制劑來抑制不希望生長的微生物，例如引入抗生素作為一種新型的能源抑制其他細(xì)菌的生長［17］;⑤其他類型凝固劑代替常用的瓊脂:常規(guī)的培養(yǎng)基中用瓊脂作為凝固劑，但是它對某些微生物具有一定程度的毒害作用，降低了可培養(yǎng)的微生物數(shù)量及種類。采用古蘭糖膠，對微生物沒有毒害作用，而且凝固效果比瓊脂更好［18］。

2.2.2 培養(yǎng)條件的改變延長培養(yǎng)時間、降低接種量濃度都可以培養(yǎng)出不可培養(yǎng)微生物。有些微生物屬于寡營養(yǎng)菌，比如在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時間延長至3個月，就可長成肉眼可見的菌落［6，10，18］，但是培養(yǎng)時間不能無限延長，培養(yǎng)時間越長，對微生物培養(yǎng)環(huán)境的無菌要求就越高［5］。降低接種量濃度也能夠使活菌數(shù)增加，這種菌并不因為接種量的降低影響它們?nèi)郝涞男纬桑?9］。

2.3 模擬自然生存環(huán)境

目前，2種新穎的自制培養(yǎng)儀器已經(jīng)發(fā)展成熟，分別是擴(kuò)散盒培養(yǎng)和含有有機(jī)或無機(jī)物質(zhì)的原位群體載體培養(yǎng)。擴(kuò)散盒由一個濾膜組成，它只允許培養(yǎng)環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)和低分子量產(chǎn)物的通過而限制細(xì)胞通過，化學(xué)物質(zhì)穿過薄膜與周圍環(huán)境因子交換，可保證微生物群落間作用的存在，提高微生物可培養(yǎng)性［20］。土壤、海洋、活性淤泥都可以在擴(kuò)散盒中培養(yǎng)出不可培養(yǎng)微生物。原位群體載體培養(yǎng)能夠有效地克服原核生物黏附在固體表面導(dǎo)致的生長限制，很多文獻(xiàn)內(nèi)已經(jīng)描述了不同載體的自然生態(tài)系統(tǒng)，例如陶瓷、鈦裝置、多孔無機(jī)基板、聚氨酯泡沫塑料等載體。包有選擇性底物的原位集合物也可以有效地培養(yǎng)出目的微生物［21］。此外，有些特殊裝置僅模擬一個或者幾個重要的物化因素來培養(yǎng)新的微生物。2009年Zeng等［22］模擬高壓環(huán)境從最深的高溫噴火口分離出嗜高壓和高溫的古生菌。還有一種是流動裝置，可以在自然環(huán)境原位溫度、壓力和液體流動的條件下連續(xù)培養(yǎng)，成功模擬深海環(huán)境中液體化學(xué)成分的變化。2007年Houghton等［23］利用這種裝置培養(yǎng)出新的微生物。

2.4 微生物群體培養(yǎng)

自然環(huán)境中微生物之間有些是通過交換代謝產(chǎn)物或者特異信號分子進(jìn)行直接的細(xì)胞交流，有些是競爭有限的生存環(huán)境［24］，有些是共同利用微量元素(如維生素)和螯合劑，因此單一的微生物培養(yǎng)不能完成復(fù)雜的細(xì)胞間相互交流。2個典型的群體培養(yǎng)的例子是多細(xì)胞培養(yǎng)裝置和生物膜，都可以實施單個物種培養(yǎng)不可能實現(xiàn)的多功能培養(yǎng)。復(fù)雜有機(jī)物的纖維素降解或甲烷轉(zhuǎn)換就是利用多細(xì)胞裝置實現(xiàn)的［25］。此外，小部分共生的微生物可以在實驗培養(yǎng)基上添加一些微量元素、共底物等可以培養(yǎng)出來。群體培養(yǎng)能夠有效地培養(yǎng)出共生和互生微生物。利用透析膜反應(yīng)器的群體培養(yǎng)方法已經(jīng)成功的從厭氧淤泥中培養(yǎng)出厭氧嗜熱的降解谷氨酸的微生物［26］。

2.5 高通量培養(yǎng)

為了從自然環(huán)境中篩選出新的生物化學(xué)分子和酶類，發(fā)展了不依賴培養(yǎng)基的高通量培養(yǎng)方法。1993年Button［27］提出稀釋培養(yǎng)法，即將微生物群體稀釋至痕量時(1～5個細(xì)胞/mL)，寡營養(yǎng)微生物可以不受其他優(yōu)勢微生物的干擾，因而可以被培養(yǎng)出來。隨后，Connon［28］采用稀釋培養(yǎng)法將微生物樣品稀釋至痕量后，采用微量細(xì)胞培養(yǎng)板和熒光原位雜交技術(shù)(FISH)分離培養(yǎng)并檢測出許多微生物，這種方法不僅能有效提高微生物的可培養(yǎng)性，還可在短期內(nèi)檢測出目標(biāo)培養(yǎng)物，并進(jìn)行大量的培養(yǎng)，提高工作效率。2005年Zengler等［29］提出細(xì)胞包囊法，將微生物樣品先進(jìn)行稀釋，然后乳化，部分微生物形成了僅含單個細(xì)胞的膠狀微滴，隨后將其裝入層析柱內(nèi)，讓培養(yǎng)液連續(xù)通過層析柱進(jìn)行流態(tài)培養(yǎng)。這種方法已從不同樣品中分離出多種細(xì)菌和真菌。2007年Ingham等［21］提出多孔微生物培養(yǎng)芯片，它是由一種獨特的多孔陶瓷做成，被分割成數(shù)千個小室，在小室中進(jìn)行獨立的微生物培養(yǎng)，營養(yǎng)分子可以通過多孔膜四處擴(kuò)散維持微生物的生長。

到目前為止，不可培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)方法仍然存在一定的局限性。這主要是由于缺乏對微生物的多樣性、生存環(huán)境以及在生物進(jìn)化中地位的認(rèn)識，也由于實驗室中無法設(shè)計微生物生長的原位環(huán)境實現(xiàn)群體培養(yǎng)。因此，必須全面理解微生物生理適應(yīng)性與群體行為，發(fā)展和革新培養(yǎng)技術(shù)，改變微生物培養(yǎng)方式，設(shè)計盡可能接近微生物生活的自然環(huán)境，培養(yǎng)出更多的“不可培養(yǎng)微生物”，從中發(fā)現(xiàn)新的酶類和化合物，使其應(yīng)用于制藥業(yè)、農(nóng)業(yè)、化工業(yè)等領(lǐng)域。

［1］ Achtman M，Wagner M.Microbial Diversity And the genetic nature of microbial species［J］.NatRev Microbio，2008，6:431-440.

［2］ Deming，J.W.，J.A.Baross.Survival，dormancy，and nonculturable cells in extreme deep-sea environments［J］.Nonculturable Microorganisms in the Enrironment，2000，147-197.

［3］ Karner，M，J.A.Fuhrman.Determination of active bacterioplankton:a comparison of universal 16S rRNA probes，autoradiography，and nucleoid staining.Appl.Environ［J］.Microbiol，1997，63:1208-1213.

［4］ Fuqua C S，C.Winans，E P Greenberg.Census and consensus in bacterial ecosystem:the LuxR-LuxI family of quorum-sensing transcriptional regulators［J］.Annu Rev Microbiol，1996，50:727-751.

［5］ Michael S，Rappe，Stephanie A，et al.Cultivation of the ubiquitous SAR11 marine bacterioplankton clade［J］.Nature vol，2002，418.

［6］ Jang-Cheon Cho，Stephen J，Giovannoni.Cultivation and Growth Characteristics of a Diverse Group of Oligotrophic Marine Gammaproteobacteria［J］.Applied and Environmental Microbiology，2004，70:432-440.

［7］ Kolodkin-Gal I，Engelberg-Kulka H.The extracellular death factor:physiological and genetic factors in uencing its production and response in Escherichia coli［J］.J Bacteriol，2008，190:3169-3175.

［8］ Pereira C S，Mc Auley J R，Taga M E，et al.a bacterium lacking the autoinducer-2(AI-2)synthase responds to AI-2 supplied by other bacteria［J］.Mol Microbiol，2008，70:1223-1235.

［9］ D.Nichols，K.Lewis，J.Orjala，et al.Short Peptide Induces an“Uncultivable”Microorganism To Grow In Vitro［J］.Appliede and environmental microbiology，2008，74:4889-4897.

［10］ Joseph S J，Hugenholtz P，Sangwan P，et al.Laboratory cultivation of widespread and previously uncultured soil bacteria［J］.Appl Environ Microbiol，2003，69:7210-7215.

［11］ Uphoff H U，F(xiàn)elske A，F(xiàn)ehr W，et al.The microbial diversity in picoplankton enrichment cultures:a molecular screening of marine isolates［J］.FEMS Microbiol Ecol，2001，35:249-258.

［12］ Ko¨pke B，Wilms R，Engelen B，et al.Microbial diversity in coastal subsurface sediments:a cultivation approach using various electron acceptors and substrate gradients［J］.Appl Environ Microbiol，2005，71:7819-7830.

［13］ Raghoebarsing A A，Pol A，van de Pas-Schoonen KT，et al.A microbial consortium couples anaerobic methane oxidation to denitrification［J］.Nature，2006，440:918-921.

［14］ Parveen Sang wan，et al.Detection and Cultivation of Soil Verrucomicrobia［J］.Applied and Environmental Microbiology，2005，71(12):8402-8410.

［15］ Leadbetter J R.Cultivation of recalcitrant microbes:cells are alive，well and revealing their secrets in the 21st century laboratory［J］.Curr Opin Microbiol，2003，6:274-281.

［16］ Stevenson B S，Eichorst S A，Wertz J T，et al.New strategies for cultivation and detection of previously uncultured microbes［J］.Appl Environ Microbiol，2004，70:4748-4755.

［17］ Ko¨nneke M，Bernhard A E，de la Torre J R，et al.Isolation of an autotrophic ammonia-oxidizing marine archaeon［J］.Nature，2005，437:543-546.

［18］ Stott M B，Crowe M A，Mountain B W，et al.Isolation of novel bacteria including a candidate division from geothermal soils in New Zealand［J］.Environ Microbiol，2008，10:2030-2041.

［19］ Davis K E R，Joseph S J，Janssen P H，Effects of growth inoculum size and incubation time on culturability and isolation of soil bacteria［J］.Appl Environ Microbiol，2005，71:826-834.

［20］ Yasumoto-Hirose M，Nishijima M，Ngirchechol M K，et al.I-solation of marine bacteria by in situ culture on media-supplemented polyurethane foam［J］.Mar Biotechnol，2006，8:227-237.

［21］ Ingham C J，Sprenkels A，Bomer J，et al.The micro-Petri dish，a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104(46):18217-18222.

［22］ Zeng X，Birrien J-L，F(xiàn)ouquet Y，et al.Pyrococcus CH1，an obligate piezophilic hyperthermophile:extending the upper pressure-temperature limits for life［J］.ISME J，2009，10:10-38.

［23］ Houghton J L，Seyfried W E Jr，Banta A B，et al.Continuous enrichment culturing of thermophiles under sulfate and nitrate-reducing conditions and at deep-sea hydrostatic pressures［J］.Extremophiles，2007，11:371-382.

［24］ Anthony D’Onofrio，Jason M，Crawford，et al.siderophores from Neighboring Organisms promote the growth of uncultured Bacteria［J］.Cell Chemistry＆Biology，2010，17:254-264.

［25］ Schink B.Ecophysiology and ecological niches of prokaryotes.In Lengeler J W，Drews G，Schlegel HG(eds)Biology of the prokaryotes［J］.Georg Thieme Verlag，Stuttgart，1999，723-762.

［26］ Plugge C M，Stams A J M.Enrichment of thermophilic syntrophic anaerobic glutamate-degrading consortia using a dialysis membrane reactor［J］.Microbial Ecol，2002，43:379-387.

［27］ Button D K，Schut F，Quang P，et al.Viability and isolation of marine bacteria by dilution culture:theory，procedures，and initial results［J］.Appl Environ Microbiol，1993，59:881-891.

［28］ Connon S A，Giovannoni S J.High-throughput methods for culturing microorganisms in very-low-nutrient media yield diverse new many isolates［J］.Appl Environ Microbiol，2002，68:3878-3885.

［29］ Zengler K Walcher M，Clark G，et al.High-throughput cultivation of microorganisms using microcapsules［J］.Methods Enzymol，2005，397:124-130.