王瑩,崔為同,楊明峰,沈世華＊

(1.中國科學(xué)院北京植物所,北京100093;2.中國科學(xué)院研究生院,北京100049)

蛋白質(zhì)組學(xué)研究已成為21世紀(jì)生命科學(xué)的重要戰(zhàn)略前沿,《科學(xué)》雜志將其列為六大研究熱點之一[1]。在后基因組時代蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展迅速,對于探索基因功能日趨重要[2]。作為有力的分子生物學(xué)手段,蛋白質(zhì)組學(xué)已被用來研究水稻(Oryza sativa)等作物生長發(fā)育和環(huán)境脅迫下蛋白質(zhì)的表達[3-5]。

蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的關(guān)鍵步驟之一是樣品的制備和分離。盡管色譜、同位素親和標(biāo)簽(ICAT)和蛋白微列陣等技術(shù)已成功應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析[6,7],雙向凝膠電泳技術(shù)(2-DE)仍然是目前分析大量復(fù)雜蛋白樣品的常用工具[8]。樣品的制備是影響2-DE有效分辨率的關(guān)鍵因素,而蛋白分辨率可影響凝膠圖像質(zhì)量和蛋白分布[9]。蛋白樣品的電泳分離常被一種或幾種含量極度豐富的蛋白干擾,這些“超高豐度蛋白”限制低豐度蛋白的分辨率[10],而且數(shù)量龐大,可遮蓋鄰近蛋白點或影響其他蛋白點的電泳遷移[11,12]。例如,核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶(rubicso)是光合作用中CO2固定的關(guān)鍵酶,也是植物中含量最豐富的蛋白[13]。葉片中rubisco含量非常豐富,在電泳共遷移過程中影響或遮蓋鄰近蛋白點[14],進而降低2-DE對低豐度蛋白的檢測率。

降低樣品體系復(fù)雜性,分離富集低豐度蛋白質(zhì)的各種預(yù)分離技術(shù)近年來發(fā)展較快,并與現(xiàn)有的分離技術(shù)相結(jié)合,大幅度提高了低豐度蛋白的檢測率[9,11,15-21]。但是,多數(shù)預(yù)分離技術(shù)比較昂貴或是耗時較長。PEG沉淀法是其中一種能夠簡單、快速地富集低豐度蛋白質(zhì)的預(yù)分離方法。Sun等[22]采用20%PEG預(yù)處理水稻蛋白樣品,rubisco大亞基為主的高豐度蛋白被分離到沉淀部分,取得很好的分離效果;Xi等[23]采用PEG分離法檢測擬南芥(Arabidopsis thaliana)中低豐度蛋白,報道rubisco大亞基可被16%PEG沉淀;Lee等[24]采用15%PEG分離法檢測了水稻幼苗葉片中響應(yīng)低溫脅迫的低豐度蛋白,取得了良好分離效果。

水稻、玉米(Zea mays)和小麥(Triticum aestivum)等禾谷類植物被廣泛研究[25-28]。葉鞘常被作為研究禾谷類作物庫源轉(zhuǎn)化的特殊器官[29],已有關(guān)于水稻灌漿期葉鞘蛋白質(zhì)組學(xué)分析的報道[30]。葉鞘也進行一部分光合作用,因此該器官內(nèi)也含有大量光合作用相關(guān)酶類,尤其是 rubisco的存在嚴(yán)重干擾葉鞘低豐度蛋白的檢測和分析,目前尚無提高葉鞘低豐度蛋白鑒定率的報道。本研究分別采用15%和20%PEG預(yù)分離法富集低豐度蛋白,旨在探索一種葉鞘低豐度蛋白的鑒定方法,為單子葉植物葉鞘蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

將水稻9311(Oryza sativa ssp.indica cultivar 93-11)于正常水稻生長季節(jié)種植于北京中國科學(xué)院植物研究所實驗溫室內(nèi),常規(guī)水肥管理。自然光照下,生長70 d左右,待水稻生長至灌漿期,剪取水稻劍葉的葉鞘作為實驗材料,液氮速凍后儲藏于-80℃冰箱里。

1.2 蛋白質(zhì)提取

1.2.1 Mg/NP-40法 蛋白質(zhì)提取方法參照Kim等[31]的方法,略作修改。將0.5 g材料在液氮中研磨成精細的粉末,然后加入3 mL預(yù)冷的Mg/NP-40提取液[0.5 mol/L T ris-HCl(pH 8.3),2%(v/v)乙基苯基聚乙二醇(NP-40),20 mmol/L氯化鎂,1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF),2%(v/v)β-巰基乙醇],在冰上充分研磨。4℃下12 791 r/min離心勻漿液10 min,棄沉淀。上清液中加入4倍體積丙酮,-20℃沉淀30 min。相同條件下再次離心后,棄上清。沉淀用丙酮清洗,4℃下12 791 r/min離心10 min,清洗3次。將沉淀真空干燥即得到可溶性全蛋白干粉(NF)。

1.2.2 Mg/NP-40法(PEG預(yù)分離) PEG沉淀方法參照Kim等[31]和Yang等[32]的方法,并作修改。將0.5 g材料在液氮中研磨成精細的粉末,然后加入3 mL預(yù)冷的Mg/NP-40提取液,在冰上研磨充分。4℃下12 791 r/min離心10 min,棄沉淀。上清中加入50%(w/v)PEG-4000至終濃度為15%或20%(w/v)?；靹?冰上沉淀30 min。4℃下12 791 r/min離心10 min。離心后上清加入4倍體積丙酮,置于-20℃沉淀30 min。4℃下12 791 r/min離心10 min,取沉淀用丙酮清洗4次后真空干燥得到15%或20%PEG預(yù)分離上清組分(AF1或BF1)。離心后沉淀用丙酮清洗4次,真空干燥得到15%或20%PEG預(yù)分離沉淀組分(AF2或BF2)。

1.3 雙向凝膠電泳

雙向凝膠電泳方法參照Yang等[32]的方法,略作修改。將蛋白干粉溶于裂解液:7 mol/L尿素,2 mol/L硫脲,4%(w/v)3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽,2%(v/v)兩性電解質(zhì)(pH 3.5～10),5%(v/v)β-巰基乙醇,1%(w/v)二硫蘇糖醇。NF、AF1、AF2、BF1和BF2蛋白上樣量均為600 μ g。第一向等電聚焦(IEF)在長13cm、直徑3mm的玻璃管內(nèi)進行。注射器灌膠[2%(v/v)NP-40,3.6%(w/v)丙烯酰胺,8 mol/L尿素,2.5%(v/v)兩性電解質(zhì)(pH 3.5～10),2.5%(v/v)兩性電解質(zhì)(pH 5～8)]。膠條聚合完全后,加入溶有蛋白樣品的裂解液,其上覆蓋30 μ L的50%裂解液。最后加入上槽電極緩沖液(20 mmol/L氫氧化鈉)及下槽電極緩沖液(6.67 mmol/L磷酸),等點聚焦200,400和800 V分別進行0.5,15和1 h。聚焦完畢后,從凝膠管中取出膠條,放入平衡緩沖液[62.5 mmol/L Tris-HCL(pH 6.8),2.5%(w/v)十二烷基磺酸鈉,10%(v/v)甘油,5%(v/v)β-巰基乙醇]中。振蕩平衡2次,每次15 min。然后轉(zhuǎn)移膠條至分離膠濃度為15%,濃縮膠濃度為5%的聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上端進行第二向垂直電泳。雙向電泳后,使用0.1%的考馬斯亮藍R-250(CBB-R-250)染色。

1.4 蛋白質(zhì)凝膠掃描及圖像分析

脫色后的凝膠用UMAX掃描儀掃描。使用ImageMaster凝膠分析軟件對凝膠進行分析。

1.5 統(tǒng)計分析

所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 14.0軟件統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 2-DE圖譜

為測試PEG分離法是否適用于灌漿期水稻葉鞘低豐度蛋白的鑒定,分別將可溶性全蛋白(NF)、15%PEG預(yù)分離的上清蛋白(AF1)、15%PEG預(yù)分離的沉淀蛋白(AF2)、20%PEG預(yù)分離的上清蛋白(BF1)和20%PEG預(yù)分離的沉淀蛋白(BF2)進行2-DE(圖1)。

經(jīng)ImageMaster 2D Platinum軟件分析,并計算各提取方法所檢測到的總蛋白種類(表1)。15%和20%PEG沉淀法預(yù)分離上清分別檢測到642和806個蛋白點,而沉淀分別檢測到882和695個蛋白點。TCA/丙酮法檢測到733個蛋白點,除去上清與沉淀中重疊的蛋白點,15%和20%PEG沉淀法檢測到的蛋白點分別為1 042和1 023個。15%和20%PEG沉淀法所得的蛋白點大概相同,均顯著(P<0.05)高于TCA/丙酮法檢測到的蛋白點數(shù)。

圖1 PEG預(yù)分離各組分與對照凝膠電泳圖譜Fig.1 Comparison of 2-DE gel electrophoresis protein patterns of Mg/NP-40 method with PEG fractionation(AF1,AF2,BF1,BF2)and no PEG fractionation(NF)

表1 不同分離方法的2-DE圖譜上蛋白點數(shù)Table 1 Number of spots of different methods

2.2 rubisco大亞基

NF的2-DE圖譜上rubisco大亞基蛋白點影響或遮蓋其周圍的蛋白點(圖2)。經(jīng)PEG沉淀后AF1和BF1圖譜上的rubisco大亞基顯著減小(P<0.05)。采用ImageMaster 2D軟件分析,以計算rubisco大亞基相對蛋白點體積在經(jīng)PEG沉淀后的變化(圖3)。未經(jīng)PEG預(yù)分離的全蛋白圖譜上,rubisco大亞基占全部蛋白的16.9%。經(jīng)15%PEG沉淀后,rubisco大亞基下降55.9%,20%PEG沉淀后下降92.7%?？梢?20%PEG沉淀rubisco的效果較好。

2.3 低豐度蛋白

與未經(jīng)PEG分離提取的蛋白2-DE圖譜相比較,PEG預(yù)分離后上清蛋白2-DE圖譜上檢測到的蛋白點的數(shù)目增多。如圖4所示,僅在2-DE圖譜的B和C兩個小區(qū)域上,PEG預(yù)分離法的采用使得可檢測蛋白點的數(shù)目顯著增多。

參照Krishnan和Natarajan[33]的方法,將PEG預(yù)分離上清蛋白2-DE膠上表達上調(diào)3倍以上,且在可溶性全蛋白圖譜上很微弱或檢測不到的蛋白點,認(rèn)為是PEG預(yù)分離法檢測到的低豐度蛋白點。使用ImageMaster 2D軟件,將AF1和BF1的2-DE圖譜分別與NF進行比較分析。結(jié)果顯示,AF1的2-DE膠上可檢測到低豐度蛋白點共有62個,而BF1可檢測到119個。顯然,20%PEG沉淀法可檢測到灌漿期水稻葉鞘中更多種類的低豐度蛋白。

圖2 PEG預(yù)分離法沉淀 rubisco大亞基效果Fig.2 PEG fractionation decreased rubisco large subunit in 2-DE analysis

圖3 不同分離方法2-DE圖譜rubisco大亞基相對豐度百分比Fig.3 Relative spot volume of rubisco large subunit using different methods

3 討論

在現(xiàn)今的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中,低豐度蛋白備受關(guān)注。細胞或組織中受體分子、信號分子等參與基因表達調(diào)控的蛋白均是低豐度蛋白,而在細胞中拷貝數(shù)眾多的高豐度蛋白,如rubisco等一般不參與基因調(diào)控[8]。結(jié)合雙向凝膠電泳的預(yù)分離技術(shù)已成為蛋白質(zhì)組學(xué)中分析低豐度蛋白的有力工具。

圖4 PEG分離法增加2-DE圖譜上可檢測低豐度蛋白點數(shù)目Fig.4 15%and 20%PEG fractionation increased detectable proteins in 2-DE analysis

以rubisco為主的高豐度蛋白的存在嚴(yán)重影響葉片低豐度蛋白的檢測和分析,文獻報道PEG分離法主要是分離沉淀rubisco大亞基[22-24]。本研究采用簡便PEG預(yù)分離方法去除水稻葉鞘中的rubisco,探索適用于水稻葉鞘低豐度蛋白的檢測方法。前人報道證明PEG可有效分離沉淀rubisco,而不同樣品蛋白的預(yù)分離所需PEG濃度不同。本研究分別采用15%和20%PEG,以測定適用于葉鞘低豐度蛋白檢測的PEG濃度。

與未經(jīng)PEG預(yù)分離的方法相比較,15%PEG沉淀可使rubisco大亞基相對蛋白點體積下降55.9%,而20%PEG沉淀法可降低92.7%。采用20%PEG預(yù)分離水稻葉鞘蛋白,可有效去除rubisco大亞基。PEG預(yù)分離的目的是富集低豐度蛋白,15%PEG沉淀法可檢測到62個低豐度蛋白,而20%PEG可檢測到119個。證明20%PEG對于灌漿期水稻葉鞘高豐度蛋白的減少和低豐度蛋白的富集效果顯著。與傳統(tǒng)的未經(jīng)PEG預(yù)分離的TCA/丙酮法相比,采用15%和20%PEG分別預(yù)分離后經(jīng)2-DE檢測到的全蛋白種類均顯著升高(P<0.05),而2種濃度PEG沉淀方法所檢測到全蛋白種類差異并不顯著。由此看來,20%PEG預(yù)分離方法不僅適于低豐度蛋白的鑒定,也適用于全蛋白表達的鑒定。

4 結(jié)論

PEG沉淀法是富集低豐度蛋白的方法之一。本研究采用水稻葉鞘為材料,分析了不同濃度PEG對rubisco的分離效果。研究發(fā)現(xiàn),20%PEG分離法非常適合于鑒定水稻葉鞘中的低豐度蛋白,這些工作可為進一步研究水稻葉鞘差異蛋白質(zhì)組學(xué)提供參考。

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