杜建文 孫海洲＊ 趙存發(fā) 李勝利 宋麗霞

尿素是動物機體蛋白質(zhì)代謝的主要終產(chǎn)物,它一直被認為是以脂質(zhì)擴散的形式進行跨膜運動的。然而,隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)在紅細胞和腎集合管末段對尿素的通透率遠高于簡單脂質(zhì)擴散,于是廣大研究者推斷存在一種控制尿素轉(zhuǎn)運的載體——尿素轉(zhuǎn)運蛋白 (urea transporter,UT)[1-3],隨后證明尿素跨膜轉(zhuǎn)運是由載體蛋白調(diào)控的[4]。1993年,You等[5]首次從兔腎臟內(nèi)髓質(zhì)層分離得到尿素轉(zhuǎn)運蛋白 -A2(UT-A2)的cDNA,為研究 UT奠定了基礎(chǔ),從而也對傳統(tǒng)的尿素轉(zhuǎn)運機制提出了挑戰(zhàn)。隨后,Olives等[6]從人骨髓中分離出了另一個 UT家族成員——尿素轉(zhuǎn)運蛋白 -B(UT-B)的 cDNA。隨著研究的深入,人們已從大量的動物中發(fā)現(xiàn)了 UT的存在,尤其是山羊消化系統(tǒng)、肝臟和唾液腺[7],牛瘤胃[8-9]以及綿羊消化系統(tǒng)[10]。眾所周知,反芻動物飼糧氮的利用率很低,一般認為其通過大量的內(nèi)源氮循環(huán)(其中大部分以尿素的形式進行循環(huán))來提高氮的利用。研究發(fā)現(xiàn),飼糧可以調(diào)控內(nèi)源氮循環(huán)[7-10],而已有研究表明 UT對尿素循環(huán)起著極其重要的作用[1-5]。本研究擬通過蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)來測定飼糧中玉米的加工方式和蛋白質(zhì)水平對內(nèi)蒙古白絨山羊消化系統(tǒng) UT-B的相對表達量,旨在研究飼糧結(jié)構(gòu)對山羊消化系統(tǒng) UT-B表達的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選用 18只體況良好、平均體重為(34.95±2.37)kg的裝有永久性瘤胃瘺管的內(nèi)蒙古白絨山羊半同胞羯羊,隨機分為 6組,每組 3個重復,每個重復 1只,單欄飼養(yǎng)。

1.2 試驗飼糧和試驗設(shè)計

試驗飼糧參照 NRC(2007)山羊營養(yǎng)需求配制。試驗用玉米分為破碎(C)和膨化(E)2種,試驗飼糧蛋白質(zhì)含量分為低(L)、中(M)、高(H)3個水平。6組試驗飼糧分別為破碎玉米低蛋白質(zhì)(CL)組、破碎玉米中蛋白質(zhì)(CM)組、破碎玉米高蛋白質(zhì)(CH)組、膨化玉米低蛋白質(zhì)(EL)組、膨化玉米中蛋白質(zhì)(EM)組和膨化玉米高蛋白質(zhì)(EH)組。CM組為對照組,代謝能為維持代謝能的 1.4倍。試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表 1。

試驗羊每天分別在 06:30和 18:30先粗后精等量飼喂,自由飲水,飼喂 45 d后每組選取 1只屠宰采樣。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(DM basis) %

1.3 樣品采集

試驗羊宰前禁食 24 h,禁水 12 h,取腮腺、瘤胃背囊和腹囊、網(wǎng)胃、瓣胃、皺胃、十二指腸(近端)、回腸、盲腸盲囊和盲腸(回盲結(jié)合部后 30 cm處)、肝臟、腎臟,用冷生理鹽水沖洗。瘤胃黏液層要從肌層剝離,腸道要把漿膜和肌膜從黏膜上剝離,樣品進行編號(表 2)后 -80℃保存待測。

表2 各組試驗羊樣品編號Table 2 The number of the samples in various organs of the goats in each group

1.4 兔抗羊多克隆抗體的制備和樣品中 UT-B的測定

多克隆抗體制備參照 Ludden等[10]的方法,免疫用多肽序列為:CEENRIFYLQSTKRTV,根據(jù)Smith等[11]描述的山羊 UT-B的 ACP18881序列合成的。

蛋白質(zhì)印跡檢測各樣品中 UT-B的表達情況,然后將 CL組試驗羊的腮腺目的蛋白(34 ku)條帶的灰度值定義為基礎(chǔ)值(1.000),計算各組織的目的蛋白(34 ku)的相對表達量(目的蛋白條帶的灰度值 /基礎(chǔ)值)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)用 Excel軟件進行整理。

2 結(jié) 果

圖1是所有被測樣品中 UT-B的免疫印跡圖,各試驗羊組織均表達了 34 ku的 UT-B,然而所有檢測的腮腺樣品中均表達了 30、50和 54 ku的UT-B,前胃(瘤胃、網(wǎng)胃和瓣胃)樣品中表達了30 ku的 UT-B,肝臟樣品中表達了 54 ku的 UT-B。此外,一些樣品中還表達了其他分子質(zhì)量的UT-B,比如 5和 6號(CL組的瓣胃和皺胃)樣品中表達了 40 ku的 UT-B、30號(CH組的瓣胃)樣品中表達了50 ku的 UT-B。研究認為,32～36 ku的UT-B為未糖基化的 UT-B,可調(diào)控尿素雙向跨消化道(瘤胃壁)轉(zhuǎn)運[8],因此本研究僅對 34 ku UT-B的相對表達量進行分析。各組試驗羊消化系統(tǒng)的34 ku UT-B的相對表達量差異性如表 3所示。相對定量分析結(jié)果:組間比較發(fā)現(xiàn),CL組 34 ku UT-B的相對表達量最高,EM組次之,CM組最低;組織間比較發(fā)現(xiàn),34 ku UT-B的相對表達量以肝臟最高,次之為皺胃、網(wǎng)胃、瘤胃背囊、腹囊、腮腺、瓣胃,隨后是十二直腸、盲腸、盲腸盲囊、回腸,腎臟最低。

3 討 論

UT-B是哺乳動物體內(nèi)存在的尿素易化轉(zhuǎn)運的載體,研究認為 UT-B是 Na-依賴性的尿素易化轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。據(jù)報道,羔羊的十二指腸、回腸和結(jié)腸[11]以及牛的瘤胃腹部[12]均存在 47 ku的UT-B。Marini等[13]研究發(fā)現(xiàn),羔羊肝臟含有 45 ku的UT-B。Ludden等[10]研究發(fā)現(xiàn),羊腮腺、瘤胃背腹囊、網(wǎng)胃、小腸、盲腸、結(jié)腸、肝臟和腎臟中都含有32和 47 ku的 UT-B,瘤胃、網(wǎng)胃和肝臟中 32 ku的UT-B較多,而在腸道中 47 ku的 UT-B較多,腎臟中 2種分子質(zhì)量的 UT-B接近,并認為 32 ku為未糖基化的 UT-B,47 ku為 UT-B的 N端糖基化形式,這類似于 Stewartg等[8]應(yīng)用 RT-PCR技術(shù)推斷出牛瘤胃 UT-B為 43～54 ku,利用尤斯灌流室技術(shù)發(fā)現(xiàn) UT-B調(diào)控尿素雙向跨瘤胃壁轉(zhuǎn)運,并發(fā)現(xiàn)36 ku為未糖基化的 UT-B。 Simmons等[9]研究飼喂青貯基礎(chǔ)飼糧和精料基礎(chǔ)飼糧的利木贊雜交肉牛發(fā)現(xiàn),飼喂精料基礎(chǔ)飼糧的肉牛瘤胃 UT-B mRNA含量顯著增加,表明 UT-B可以調(diào)節(jié)氮代謝平衡。本研究所測樣品中 UT-B基本在 30～54 ku且各組織均含有 34 ku的 UT-B,其他分子質(zhì)量的UT-B的表達與否因飼糧和組織不同呈現(xiàn)差異。

表3 各組試驗羊消化系統(tǒng) 34 ku UT-B的相對表達量Table 3 The relative expression quantity of 34 ku UT-B in digestive system of the goats in each group

研究表明,飼喂低蛋白質(zhì)飼糧會增加反芻動物消化道對尿素的通透性[9,13-14]。一般認為,低蛋白質(zhì)飼糧可以促進動物消化道及其他組織中UT的表達。Inoue等[12]研究發(fā)現(xiàn),低蛋白質(zhì)飼糧促進大鼠腎臟 UT-B的表達,低蛋白質(zhì)飼糧使大鼠結(jié)腸 UT-B表達稍有降低,高蛋白質(zhì)飼糧則變化不顯著。飼喂高蛋白質(zhì)飼糧的奶牛瘤胃背囊乳頭中UT-B表達增強[14],這與本研究結(jié)果相同。本研究還發(fā)現(xiàn),瘤胃腹囊、網(wǎng)胃、瓣胃、回腸、盲腸盲囊以及腎臟中的 34 ku UT-B的相對表達量隨著飼糧蛋白質(zhì)水平增加而增加。本研究中,飼糧結(jié)構(gòu)對腮腺 UT-B表達的影響最小,皺胃最大;飼糧高蛋白質(zhì)水平可促進前胃、回腸、盲腸及盲囊和腎臟中34 ku UT-B的表達,對十二直腸起抑制作用,對腮腺、皺胃和肝臟的影響較小,玉米膨化加工只降低了34 ku UT-B在回腸和肝臟的表達;從組織層次看,34 ku UT-B相對表達量最高為肝臟,次之為皺胃、網(wǎng)胃、瘤胃、腮腺、瓣胃,隨后為腸道組織,腎臟最低。因此,可以認為飼糧結(jié)構(gòu)可調(diào)控 34 ku UT-B在山羊消化系統(tǒng)中的表達。

4 結(jié) 論

在綜合考慮飼糧蛋白質(zhì)水平和碳水化合物的形式對內(nèi)蒙古白絨山羊瘤胃內(nèi)環(huán)境的影響的情況下,通過改變飼糧結(jié)構(gòu)可以調(diào)控山羊消化系統(tǒng)各組織中的 UT-B的表達,為進一步研究尿素循環(huán)和機體氮代謝提供依據(jù)。

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