羅 璽，唐慶九*，張勁松，周 帥，吳 迪，劉艷芳，王 琪，喬彥茹，楊 焱，趙明文

(1.國家食用菌工程技術研究中心，農業(yè)部應用真菌資源與利用重點開放實驗室，上海市農業(yè)遺傳重點開放實驗室，上海市農業(yè)科學院食用菌研究所，上海 201106；2.南京農業(yè)大學生命科學學院微生物系，江蘇 南京 210095；3. 河北省食用菌研究所，河北 石家莊 050035)

靈芝多糖樹脂法脫色工藝優(yōu)化

羅 璽1,2,3，唐慶九1,*，張勁松1，周 帥1，吳 迪1，劉艷芳1，王 琪1,2，喬彥茹1，楊 焱1，趙明文2

(1.國家食用菌工程技術研究中心，農業(yè)部應用真菌資源與利用重點開放實驗室，上海市農業(yè)遺傳重點開放實驗室，上海市農業(yè)科學院食用菌研究所，上海 201106；2.南京農業(yè)大學生命科學學院微生物系，江蘇 南京 210095；3. 河北省食用菌研究所，河北 石家莊 050035)

利用大孔樹脂對靈芝多糖進行脫色。比較10種大孔樹脂在脫色方面的性能，以靈芝多糖的脫色率和多糖保留率為考察指標，結果發(fā)現D303樹脂的脫色效果最佳，通過單因素試驗和正交試驗對D303樹脂的靈芝多糖脫色各種工藝參數進行優(yōu)化，得到D303樹脂靜態(tài)脫色的最佳參數為在樣品上樣質量濃度15mg/mL、pH6、脫色溫度50℃、脫色時間7h條件下，靈芝多糖溶液的脫色率可達91.89%，多糖保留率75.28%；D303樹脂動態(tài)脫色的最佳參數為上樣流速3BV/h、每毫升樹脂上樣量150mg，此條件下靈芝多糖溶液的脫色率可達92.01%，多糖保留率71.85%。研究表明D303樹脂適合應用于靈芝多糖的脫色工藝。

靈芝；多糖；脫色；樹脂

靈芝(Ganoderma lucidum (Curtis∶Fr.) P.Karst)為多孔菌科的擔子菌，在我國是一種重要藥用真菌，作為藥用已有2000多年的歷史[1]。大量研究表明靈芝多糖是其主要活性成分之一，具有免疫調節(jié)[2-4]、抗腫瘤[5-7]、抗氧化[8]、抗病毒、降血糖和保肝等藥理作用。

傳統(tǒng)工藝提取的靈芝多糖產品顏色深、雜質多，不利于作為功能性食品或藥品進一步研究與開發(fā)。為去除產品中的色素，需要對其進行脫色處理。傳統(tǒng)脫色方法一般有活性炭吸附、雙氧水氧化法[9]等，其中活性炭法脫色時間較長，多糖保留率低，雙氧水是強氧化劑，容易破壞多糖結構，影響其活性[10]。

大孔樹脂技術是上世紀七十年代發(fā)展起來的一種新工藝，近年來常應用于色素精制[11]及中藥提取分離。大孔樹脂具有物理化學穩(wěn)定性高、比表面積大、處理能力大、選擇性好、吸附速度快、解吸條件溫和、再生處理方便、使用周期長、成本不高等諸多優(yōu)點，運用大孔樹脂的分離工藝所得提取物體積小、不吸潮，容易制成外型美觀的產品，解決了產品的粗、大、黑等問題[12]。本實驗探討大孔吸附樹脂和大孔離子交換樹脂對靈芝多糖的脫色情況，采用單因素和正交試驗對脫色條件進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝原材料為上海市食用菌所靈芝品種(滬農1號)，在安徽金寨靈芝基地栽培獲得；Balb/c小鼠(SPF級，8～10周齡，體質量28g±2g) 中國科學院上海實驗動物研究中心；小鼠RAW264.7骨髓巨噬細胞株 美國國家菌種保藏中心。

D303、D315、335、HZ202、HZ801、HZ806、HZ816、JK206樹脂 上海華震科技有限公司；D-900、MG-1樹脂 滄州寶恩吸附材料科技有限公司；無色RPMI1640培養(yǎng)基；0.05%胰蛋白酶；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS) 美國Gibco公司；抗生素(青霉素和鏈霉素) 美國Amresco公司；Alamar Blue試劑 美國Biosource公司；植物凝集素(phytohemagg lutinin，PHA)、5-Fu 美國Simga-Aldrich公司；95%乙醇、苯酚、濃硫酸、鹽酸及氫氧化鈉均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

BC-R2001型旋轉蒸發(fā)儀 上海貝凱生物化工設備有限公司；Synergy HT型多功能酶標儀 美國Bio-Tek公司；UF-3530超濾膜 上海弗立特實業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樹脂的預處理

大孔離子交換樹脂D303、D315、335、JK206、 D-900用2倍體積4% NaOH溶液攪拌浸泡2h，蒸餾水洗至中性，再用2倍體積4% HCl溶液攪拌浸泡2h，蒸餾水洗至中性，再用2倍體積4% N aOH溶液攪拌浸泡2 h，蒸餾水洗至p H 8，備用。

大孔吸附樹脂HZ202、HZ801、HZ806、HZ816、MG-1用95%乙醇攪拌浸泡4h，使其充分溶脹，然后用乙醇重復洗至洗滌液在試管中加3倍水不顯渾濁為止，用蒸餾水洗至無醇味，備用。

1.3.2 靈芝粗多糖的制備

1kg靈芝子實體粉碎后，按料液比1∶20(g/mL)加水，沸水浸提2h，過濾，濾渣再沸水提取一次后過濾，合并兩次提取的濾液。濾液濃縮至10L后，將濃縮液轉到UF-3530超濾膜上進行超濾(選用截留分子質量為10000D和500000D的超濾膜)，冷凍干燥最終得到10000～500000D的靈芝粗多糖干品。

1.3.3 靜態(tài)試驗粗篩樹脂

準確量取50mL經預處理的10種樹脂于250mL三角瓶中，加入40mL 40mg/mL 10000～500000D靈芝多糖粗提物溶液，置于搖床中，120r/min、25℃振蕩24h，取上清液在波長450nm處測定吸光度計算脫色率，測定多糖含量計算多糖保留率。

1.3.4 不同型號樹脂脫色后的靈芝多糖粗提物對巨噬細胞產生NO的刺激試驗

將樣品用PBS溶解并配成20、100、500μg/mL的溶液(終質量濃度2、10、50μg/mL)，以10μg/mL的LPS為陽性對照(終質量濃度1μg/mL)、PBS為陰性對照，參照文獻[13]方法測定不同型號樹脂脫色后的靈芝多糖粗提物對巨噬細胞產生NO的刺激作用。

1.3.5 不同型號樹脂脫色后的靈芝多糖粗提物刺激淋巴細胞增殖試驗

將樣品用PBS溶解并配成200、500、1000μg/mL溶液(終質量濃度20、50、100μg/mL)，以60μg/mL的PHA為陽性對照(終質量濃度6μg/mL)，PBS為陰性對照，參照文獻[14]的方法測定不同型號樹脂脫色后的靈芝多糖粗提物對淋巴細胞的增殖作用。

1.3.6 單因素試驗和正交試驗

靜態(tài)試驗結合細胞試驗篩選出的樹脂，以靈芝多糖粗提物溶液的脫色時間、溫度、pH值和樣品質量濃度為單因素條件，測定并計算不同條件下的脫色率及多糖保留率，在單因素試驗基礎上設計正交試驗，優(yōu)化脫色條件。

1.3.6.1 靜態(tài)吸附動力學試驗

準確量取處理好的大孔樹脂5mL，加入20mg/mL 40mL靈芝多糖粗提物，置于搖床中，120r/min、20℃脫色。取上清液在450nm測定吸光度計算脫色率。

1.3.6.2 溫度對樹脂脫色的影響

準確量取大孔樹脂5mL，加入20mg/mL 40mL靈芝多糖粗提物，分別在10、20、30、40、50、60℃，置于搖床中，120r/min、pH7脫色100min，取上清液在波長450nm處測定吸光度計算脫色率，測定多糖含量計算多糖保留率。

1.3.6.3 pH值對樹脂脫色的影響

準確量取大孔樹脂5mL，加入20mg/mL 40mL靈芝多糖粗提物，將樣品溶液pH值調為4、6、7、8、10、12，置于搖床中，120r/min、20℃脫色60min，取上清液在波長450nm處測定吸光度計算脫色率，測定多糖含量計算多糖保留率。

1.3.6.4 樣品質量濃度對樹脂脫色的影響

準確量取大孔樹脂5mL，加入40mL靈芝多糖粗提物，樣品溶液事先配成5、10、15、20、30、40mg/mL，置于搖床中，120r/min、20℃、pH7脫色6h，取上清液在波長450nm處測定吸光度計算脫色率，測定多糖含量計算多糖保留率。

1.3.6.5 靈芝多糖粗提物脫色正交試驗

在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗法確定10000～500000D的靈芝多糖粗提物的最佳脫色條件，按照L9(34)正交表設計試驗(表1)。

表1 靈芝多糖粗提物脫色正交試驗因素及水平Table 1 Factors and their levels in orthogonal array design

1.3.7 動態(tài)試驗

1.3.7.1 上樣流速對樹脂脫色的影響

取預處理好的D303樹脂10mL濕法裝住(φ1.7cm× 30cm玻璃層析柱)，樣品溶液分別以1、3、3.5、4.5BV/h的流速進行動態(tài)脫色試驗(1BV＝10mL)。在450nm波長處測定上清液的吸光度，計算脫色率。

1.3.7.2 上樣量對樹脂脫色的影響

取預處理好的D303樹脂10mL濕法裝住(φ1.7cm× 30cm玻璃層析柱)，將15mg/mL樣品溶液以3BV/h的流速經過大孔樹脂層析柱，分段收集流出液，在波長450nm處測定上清液的吸光度，并計算脫色率，測定多糖含量，并計算多糖保留率。

1.3.8 分析方法

1.3.8.1 脫色率的測定及計算方法

將靈芝多糖粗提物溶液在200～800nm波長范圍內進行全波長掃描，發(fā)現溶液在可見光區(qū)無吸收峰，而在380～550nm的吸收呈遞減趨勢。根據互補色原理可知，溶液呈現的顏色是它吸收光的互補色，由于多糖溶液脫色前后稀釋后均為橙黃色，所以溶液主要吸收藍色波段可見光。因此選擇處于該波段中心的450nm波長為檢測波長，測定溶液的吸光度，并計算脫色率。

1.3.8.2 多糖保留率的測定

采用苯酚-硫酸法[15]測定靈芝粗多糖脫色前后的多糖含量。

2 結果與分析

2.1 樹脂粗篩

通過10種樹脂對靈芝多糖的脫色率和多糖保留率的比較發(fā)現(表2)，在弱陰離子交換樹脂D303、D315、335、D-900中，D303和D315脫色效果好，多糖保留率較高，適合靈芝多糖溶液的脫色。強陰離子交換樹脂HZ202、JK206對靈芝多糖的吸附比較大，多糖損失多，故保留率均極低，不適合靈芝多糖溶液的脫色。大孔吸附樹脂HZ801、HZ816(非極性)、吸附樹脂HZ806 (中極性)和MG-1(強極性)中，HZ801和HZ816多糖保留率較低，MG-1脫色率較低，不適合靈芝多糖溶液的脫色。綜合考慮多糖保留率、脫色率，D303、D315、HZ806這3種型號的大孔樹脂脫色效果較好。

表2 10種樹脂的脫色能力比較Table 2 Comparison of decolorization performance of 10 types of macroporous resin

2.2 體外刺激RAW264.7巨噬細胞株生成NO試驗

靈芝多糖主要具有調節(jié)免疫的功能，具有激活巨噬細胞作用，對樹脂處理前后的靈芝多糖刺激巨噬細胞活性進行比較發(fā)現(圖1)，在2～50μg/mL的質量濃度條件下，處理前的樣品以及經D-900、JK206、HZ202、HZ801、HZ806、HZ816樹脂脫色處理后的樣品，不能刺激巨噬細胞產生NO，MG-1脫色處理后的樣品僅在高濃度下才有刺激NO產生的作用，而經D315、D303、335樹脂處理后的樣品，活性明顯增強，可明顯刺激巨噬細胞產生NO。

圖1 不同型號樹脂脫色后靈芝多糖對巨噬細胞產生NO的影響Fig.1 Effect of Ganoderma lucidum polysaccharides decolorized by 10 types of macroporous resin on nitrite production by macrophages

2.3 體外刺激淋巴細胞增殖試驗

同時對靈芝多糖脫色前后對淋巴細胞的刺激作用進行比較發(fā)現(圖2)，在20～100μg/mL質量濃度條件下，處理前的樣品和經HZ806樹脂脫色處理的樣品對淋巴細胞沒有明顯增殖作用，而經D315、D303樹脂處理后的樣品能明顯刺激淋巴細胞增殖。

圖2 不同型號樹脂脫色后靈芝多糖對淋巴細胞增殖的影響Fig.2 Effect of Ganoderma lucidum polysaccharides decolorized by 10 types of macroporous resin on lymphocyte proliferation rate

綜合考慮脫色率、多糖保留率以及免疫活性3個指標，最終選擇D315、D303兩種型號的樹脂做進一步脫色試驗。

2.4 單因素和正交試驗

2.4.1 靜態(tài)吸附色素動力學過程

由圖3可知，隨著時間的延長，D303樹脂脫色效果明顯增強，D303樹脂到6h后，脫色率增加緩慢，幾乎不再變化，色素的吸附和解吸達到了平衡，因此D303樹脂最佳脫色時間為6h。D315樹脂脫色緩慢，吸附色素的平衡時間大于12h，不利于試驗研究，并且24h后的脫色率明顯不如D303樹脂，故后面的試驗以D303為主要研究對象。

圖3 靜態(tài)吸附色素動力學曲線Fig.3 Dynamic decolorization curves of types D303 and D315 macroporous resins

2.4.2 溫度對脫色效果的影響

圖4 溫度對D303脫色效果的影響Fig.4 Effect of temperature on decolorization rate and polysaccharide retention rate

由圖4可知，隨著溫度的增加，色素分子擴散速度加快，多糖溶液的黏度下降，有利于色素的吸附。D303樹脂達到40℃后，脫色率變化緩慢，溫度對多糖保留率的影響不大，多糖保留率一直保持在80%左右，考慮到加熱設備等因素，D303樹脂最佳脫色溫度設為40℃。

2.4.3 pH值對脫色效果的影響

圖5 pH值對D303脫色效果的影響Fig.5 Effect of pH value on decolorization rate and polysaccharide retention rate

由圖5可知，在pH6時，D303樹脂脫色效果最佳，這可能與靈芝多糖溶液中的色素在偏酸性條件下表現為弱極性或非極性有關。當樣品溶液堿性太強時，某些色素分子性質可能發(fā)生改變，使得樣品溶液顏色加深，從而使脫色率降低，多糖保留率一直保持在80%左右，故D303樹脂最佳pH值為6。

2.4.4 樣品上樣質量濃度對脫色效果的影響

由圖6看出，隨著上樣質量濃度的增加，脫色率下降，多糖保留率提高，在上樣質量濃度為10～15mg/mL范圍內，脫色率開始明顯下降，在20mg/mL時脫色率已經降低到90%以下，故D303樹脂上樣質量濃度設為10～15mg/mL。

圖6 樣品上樣質量濃度對D303脫色效果的影響Fig.6 Effect of sample concentration on decolorization rate and polysaccharide retention rate

2.4.5 靈芝多糖粗提物脫色正交試驗

表3 靈芝多糖粗提物脫色正交試驗設計及結果Table 3 Orthogonal array design and corresponding experimental results

由表3脫色率極差分析可知，pH值對脫色率影響較大，溫度次之，上樣質量濃度對脫色率影響最小。偏堿性或偏酸性條件下，可能改變了色素分子的某些性質，如所帶的電荷、疏水性、極性，以及與樹脂形成氫鍵的能力，故pH值對大孔樹脂的脫色能力影響較大。D303樹脂最佳脫色條件為溫度50℃、pH6、上樣質量濃度10mg/mL、脫色時間6h。

由表3多糖保留率極差分析可知，脫色時間對于多糖保留率影響較大，上樣質量濃度次之，溫度對多糖保留率影響最小。D303樹脂最佳多糖保留率條件為溫度40℃、pH7、上樣質量濃度15mg/mL、脫色時間7h。

綜合脫色率及多糖保留率的極差分析表，最終確定D303樹脂對10000～500000D的靈芝多糖粗提物的最佳脫色工藝為脫色溫度50℃、pH6、上樣質量濃度15mg/mL、脫色時間7h。在此條件下測得靈芝多糖粗提物脫色率可達到91.89%，多糖保留率達75.28%。

2.5 動態(tài)試驗

2.5.1 上樣流速對樹脂脫色的影響

圖7 上樣流速對D303脫色效果的影響Fig.7 Effect of sample loading flow rate on decolorization rate

由圖7看出，隨著上樣體積的增加，脫色率降低。當流速為1BV/h時，脫色率較高且降低緩慢，流速低有利于色素在樹脂柱中充分擴散，使其充分被樹脂吸附，但是流速過慢，影響生產效率，延長了脫色的生產周期。流速過高時，色素沒有充分被樹脂吸附，造成脫色率的快速下降。綜合考慮，最佳上樣流速設為3BV/h。

2.5.2 上樣量對樹脂脫色的影響

由圖8可看出，隨著上樣體積的不斷增加，脫色率逐漸下降，多糖保留率逐漸升高，在上樣質量濃度15mg/mL條件下，上樣量150mg時，脫色率開始明顯下降，多糖保留率上升緩慢，說明樹脂已達到飽和，飽和上樣量為每毫升樹脂150mg。

在上樣流速3BV/h、每毫升樹脂上樣量150mg條件下，測得靈芝粗多糖溶液的脫色率可達到92.01%，多糖保留率71.85%。

圖8 上樣量對D303脫色效果的影響Fig.8 Effect of sample loading amount on decolorization rate and polysaccharide retention rate

3 討 論

采用大孔離子交換樹脂和大孔吸附樹脂對靈芝多糖粗提物進行脫色處理，以脫色率、多糖保留率以及免疫活性3個指標篩選出D303樹脂脫色效果最好。試驗結果表明非極性和弱陰離子樹脂的脫色效果較好，推測靈芝中的色素可能為陰離子型的非極性或弱極性物質。D303等弱陰離子交換樹脂，對多糖的吸附較弱，所以多糖保留率較高，經脫色后的靈芝粗多糖免疫活性提高，可能因為其吸附色素或者其他物質，這些物質可能對免疫活性具有抑制作用，所以這類物質去除后靈芝粗多糖免疫活性顯著提高，對于這類物質是否具有免疫抑制作用還需做進一步研究。HZ202等強陰離子交換樹脂，對多糖的吸附強，部分活性多糖大量損失，所以經脫色后的靈芝多糖免疫活性很低，不適合靈芝多糖的脫色；HZ801、HZ806等大孔吸附樹脂在吸附色素的同時，也對多糖有吸附作用，可能吸附了具有活性的靈芝多糖，因此經其脫色后靈芝多糖免疫活性仍然很低，不適合靈芝多糖的脫色。因此弱陰離子交換樹脂是一種適合用于靈芝多糖脫色的樹脂。

通過單因素和正交試驗對其進行優(yōu)化，獲得D303樹脂最佳靜態(tài)脫色工藝：樣品上樣質量濃度15mg/mL、pH6、脫色溫度50℃、脫色時間7h，在此條件下測得靈芝多糖粗提物脫色率可達到91.89%，多糖保留率75.28%；D303樹脂最佳動態(tài)脫色工藝為上樣流速3BV/h、每毫升樹脂上樣量150mg，在此條件下測得靈芝多糖粗提物脫色率可達到92.01%，多糖保留率71.85%。通過D303樹脂的處理，達到了較滿意的脫色效果和較高多糖保留率，同時顏色由褐色變成淡黃色。

目前，大孔樹脂脫色工藝已經在生產和研究中得到大量的應用，如利用AB-8樹脂對低分子質量靈芝多糖脫色，脫色率可達87.3%[10]；采用AB-8樹脂對桑葉粗多糖溶液脫色，脫色率可達82%[16]；采用LSA-800B樹脂對大棗多糖提取液的脫色，對色素的吸附率可達91.2%[17]。在中藥新藥的開發(fā)和中成藥的生產上，一些企業(yè)也大量應用大孔樹脂的脫色技術，用于改善產品的外觀，提高有效成分的含量。靈芝多糖脫色工藝的研究改善了靈芝多糖產品的外觀，為靈芝藥物的研發(fā)提供一定參考。

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Optimization of Decolorization Technology of Ganoderma lucidum Polysaccharides by Macroporous Resin Adsorption Method

LUO Xi1,2,3，TANG Qing-jiu1,*，ZHANG Jin-song1，ZHOU Shuai1，WU Di1，LIU Yan-fang1，WANG Qi1,2，QIAO Yan-ru1，YANG Yan1，ZHAO Ming-wen2
(1. National Engineering Research Center of Edible Fungi, Key Laboratory of Applied Mycological Resources and Utilization, Ministry of Agriculture, Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding, Institute of Edible Fungi, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201106, China；2. Department of Microbiology, College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China；3. Institute of Edible Fungi of Hebei Province, Shijiazhuang 050035, China)

The purpose of this study was to develop a macroporous resin adsorption method for the decolorization of Ganoderma lucidum polysaccharides. Ganoderma lucidum polysaccharides with a molecular weight between 10 kD and 500 kD were obtained by extracting Ganoderma lucidum fruiting bodies twice with boiling water, concentrating and ultrafiltrating with different MWCO (10 kD and 500 kD) membranes. Ten types of macroporous resin were compared for their effectiveness in decolorizing the polysaccharides. Based on decolorization rate and polysaccharide retention rate, type D303 macroporous resin had the best decolorization performance. Process parameter optimization for the decolorization of Ganoderma lucidum polysaccharides by static adsorption of type D303 macroporous resin were performed using one-factor-at-a-time combined with orthogonal array design method. The optimum conditions for static decoloration of resin D303 were as follows∶ sample concentration 15 mg/mL, pH 6, decoloration temperature 50 ℃, and decoloration time 7 h. Under the optimal conditions, a decoloration rate of 91.89% and a polysaccharide retention rate of 75.28% were obtained. The optimum conditions for dynamic decoloration of resin D303 were as follows∶ flow rate 3 BV/h (1 BV=10 mL), and sample loading amount 150 mg/mL resin, resulting in a decoloration rate of 92.01% and a polysaccharide retention rate of 71.85%. These findings collectively indicated that the resin D303 was more suitable for the decoloration of Ganoderma lucidum polysaccharides.

Ganoderma lucidum；polysaccharide；decoloration；resin

R284.2；TQ929.2

A

1002-6630(2011)16-0005-06

2010-10-13

國家“863”計劃項目(2007AA10Z341)

羅璽(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為靈芝多糖的分離純化工藝。E-mail：sjzlxcandy@163.com

*通信作者：唐慶九(1969—)，女，副研究員，博士，研究方向為藥用真菌活性成分及藥理活性。E-mail：tangqingjiu2003@yahoo.com.cn