呂 靜，李彥希，薛 梅，柯 丹

幽門螺桿菌感染致慢性蕁麻疹誘發(fā)或加重的機制探討

呂 靜，李彥希，薛 梅，柯 丹

目的 觀察幽門螺桿菌（Helicobacter pylori, Hp）感染的BALB/c小鼠模型外周血及胃黏膜組胺和類胰蛋白酶的變化，以探討Hp在誘發(fā)慢性蕁麻疹（CU）或使病情加重過程中的機制。方法 90只健康BALB/c小鼠隨機分成3組（實驗1組、實驗2組和對照組），每組各30只。實驗1、2兩組分別灌胃高毒力株（VacA+ CagA+）和低毒力株（VacA- CagA+）Hp菌懸液，對照組灌胃牛血清白蛋白（BAS）。分別采用組胺熒光測定法、類胰蛋白酶免疫組化法及ELISA法檢測三組標本灌胃前后外周血、胃黏膜組胺和類胰蛋白酶含量。 結果 實驗1、2組小鼠外周血及胃黏膜組胺含量均高于對照組（P＜0.01），實驗1、2兩組小鼠外周血組胺含量無顯著性差異（P＞0.01），但實驗1組小鼠胃黏膜內(nèi)組胺含量低于實驗2組（P＜0.01）；實驗1、2兩組小鼠外周血及胃黏膜類胰蛋白酶含量均高于對照組（P＜0.01），實驗1組小鼠胃黏膜類胰蛋白酶含量低于實驗2組（P＜0.01），但外周血類胰蛋白酶含量高于實驗2組（P＜0.01）。結論 Hp感染可導致小鼠模型外周血及胃黏膜組胺和類胰蛋白酶含量均增加，這可能是Hp誘發(fā)或加重CU的重要原因之一。

幽門螺桿菌；慢性蕁麻疹；毒力；組胺；類胰蛋白酶

[J Pract Dermatol, 2011, 4(1):12-15]

慢性蕁麻疹（chronic urticaria，CU）是皮膚科常見的變態(tài)反應性疾病，嚴重影響患者生活質量，癥狀的產(chǎn)生主要為肥大細胞和嗜堿性粒細胞活化后釋放組胺、蛋白水解酶、合成和分泌化學介質、細胞因子所引起。近年來，幽門螺桿菌（helicobacter pylori，Hp）感染與慢性蕁麻疹的關系逐漸被研究人員所認識，肥大細胞脫顆粒導致皮膚、粘膜小血管擴張和通透性增加是蕁麻疹發(fā)生的關鍵，而Hp感染可能導致肥大細胞脫顆粒的增加從而誘發(fā)或加重性慢性蕁麻疹[1]。但目前對Hp感染后肥大細胞脫顆粒的量化測定尚無相關文獻報道，故本研究擬從肥大細胞脫顆粒的標志物組胺和類胰蛋白酶入手，采用免疫熒光、免疫組化、ELISA等方法來測定二者在Hp感染的小鼠模型外周血及胃黏膜的含量，從而定量的判斷Hp感染后肥大細胞脫顆粒的情況，從發(fā)病機制的角度進一步探討Hp感染誘發(fā)或加重CU的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級BALB/c小鼠90只，6～8周齡，體重17～20g，雌雄各半。飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學微生物教研室動物房，清潔喂養(yǎng)。隨機分成實驗1組、實驗2組和對照組，每組30只。

1.1.2 菌株 采用重慶醫(yī)科大學病原微生物實驗室分離培養(yǎng)的高毒力Hp菌株 NC11637（VacA+ CagA+，空泡毒素陽性菌株）和低毒力Hp菌株NC11638（VacACagA+，空泡毒素陰性菌株）。Hp菌株經(jīng)Hpylori選擇性培養(yǎng)基純培養(yǎng)3天后，用PH7.0的布氏肉湯洗滌，麥氏比濁管比色，調(diào)整菌液濃度為2×109cfu/ ml，采用腦心浸液加甘油制成的冷凍保存液置于-70℃低溫保存，備用。

1.1.3 主要試驗儀器及試劑 RF-540型熒光分光光度計（日本島津儀器公司），光學顯微鏡、光學顯微鏡照相系統(tǒng)（日本Olympus公司），96孔酶標板（Falcon公司）。Helico Blot試劑盒（新加坡Genelabs Diagnostics公司），Hp-Ab檢測試劑盒（上海天呈科技有限公司），鼠抗單克隆抗體（福建邁新公司），小鼠抗人類胰蛋白酶抗體由重慶醫(yī)科大學免疫實驗室惠贈。三羥甲基氨基甲烷（Tris），NaCl，牛血清白蛋白（BSA），疊氮鈉（NaN3），Hepes，EDTA. Na2，二乙醇胺（DEA），氯化鎂，對硝基苯磷酸（pNPP），連接鏈霉親和素的堿性磷酸酶（strepavidinalkalinephosphatase，SAV-AP）等試劑均購自上海生工公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 每組實驗動物各30只。實驗前，1、2組小鼠禁食24h，3% NaHCO30.2ml中和胃酸，分別以2×109CFU/ml的高毒力（VacA+ CagA+）和低毒力（VacA- CagA+）Hp菌懸液0.5ml灌胃，4h后恢復食水供給。上述操作每3日重復一次，共7次。對照組以2% BAS溶液0.5ml灌胃，操作方式同上。末次灌喂后10天檢測小鼠外周血的抗-Hp抗體和快速尿酶實驗，同時進行胃黏膜細菌培養(yǎng)，結果顯示實驗1、2組中各有24只模型制作成功，感染率為80%。

1.2.2 標本采集 末次灌胃后第10天，小鼠處死前抽取0.5ml肝素抗凝全血兩份，一份用于組胺熒光測定，一份用于類胰蛋白酶ELISA法測定。頸椎脫位法將小鼠全部處死，于無菌超凈臺中取出胃組織，用滅菌生理鹽水清洗胃中內(nèi)容物，沿胃大彎將胃黏膜縱切四等份，分別用于胃黏膜Hp培養(yǎng)、快速尿素酶實驗、組胺熒光測定和類胰蛋白酶免疫組化測定。

1.2.3 外周血及胃黏膜組胺含量測定 根據(jù)向軍儉[2]微量組胺熒光測定法，用RF-540型熒光分光光度計在激發(fā)波長360nm、熒光波長450nm下測定熒光強度，根據(jù)熒光強度算出外周血及胃粘膜組胺含量（測定組胺的工作曲線回歸方程為F=1.579C+37.622，相關系數(shù)r=0.9995，線性范圍為1.01×10-9～9.01 ×10-7ug/L-1，檢出限為4.51×10-9mol/L，回收率為92.9%～112.5%）。

1.2.4 外周血及胃黏膜樣本類胰蛋白酶含量測定取10%甲醛固定的胃黏膜組織，經(jīng)石蠟包埋、切片后進行HE染色和免疫組化超敏SP法作MCT染色。后者一抗為鼠抗單克隆抗體，操作步驟按試劑盒說明書進行。試劑盒中隨帶的對照片為陽性對照，PBS替代一抗作陰性對照。MCT染色片在BI-2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)上分析，隨機取l0個視野進行MCT陽性顆粒的平均計數(shù)。采用陸超等[3]所建立的類胰蛋白酶ELISA檢測方法對血樣本中的類胰蛋白酶進行檢測：將抗人類胰蛋白酶抗體B12加入包被液中混勻，每孔加100μl，4℃過夜。用封阻液（0.01mol/I Tris，1.0mol/L NaC1，0.1%BSA，0.1% NaN，PH 8.5）封阻30 min．再用封阻液清洗3次，每次15 min，最后蒸餾水清洗3次。標準品用稀釋液（0.01mol/L Hepes，0.5mol/L NaCl，25 mmol/L EDTA.Na2，0.1% BSA，0.05% NaN3，PH7.4）稀釋至所需濃度（0.1、0.3、0.6、1.0、3.0、6.0、10 ng/ ml），用稀釋液按1∶4稀釋血清標本，樣品與標準品均100μl/孔加樣，作3復孔，4℃ 過夜。洗板同上。每孔加100μl溶于稀釋液的生物素化第二抗體G3，濃度500 ng/ml，4℃ 放置2 h。洗板同上。SAV-AP與稀釋液以1∶2000稀釋，100μl/孔，常溫放置1h。洗板同上。加顯色液（1mol/L DEA，0.01% MgCl2，0.1%NaN3，PH 9.8）100μl/孔，臨用前加入pNPP使其終濃度為10 mg/ml，37℃ 溫育。分別在15 min、45 min、1 h讀數(shù)。

1.2.5 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 外周血及胃黏膜中組胺含量比較

實驗1、2組小鼠胃黏膜內(nèi)及外周血中組胺含量均較對照組升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；實驗1組小鼠胃黏膜內(nèi)組胺含量低于實驗2組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），但外周血組胺含量無顯著性差異（P＞0.01）（表1）。

表1 外周血及胃黏膜組胺含量測定結果 （±s）

表1 外周血及胃黏膜組胺含量測定結果 （±s）

組別 n 血組胺（ug/L-1）胃粘膜組胺（ug/g-1）實驗1組 24 80.44±10.15 12.50±2.44實驗2組 24 79.28±12.02 16.66±4.41對照BAS組 30 56.43±9.88 7.89±1.24

2.2 外周血及胃黏膜中類胰蛋白酶含量比較

實驗1、2兩組小鼠外周血及胃黏膜中類胰蛋白酶含量均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；實驗1組外周血類胰蛋白酶含量高于實驗2組，但胃黏膜類胰蛋白酶含量低于后者，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（表2）。

表2 外周血及胃黏膜類胰蛋白酶含量測定結果（±s）

表2 外周血及胃黏膜類胰蛋白酶含量測定結果（±s）

組別 n 血類胰蛋白酶（ng/ml）胃MCT（個/10視野）實驗1組 24 2.08±1.12 21.33±3.25實驗2組 24 1.41±0.98 30.98±3.90對照BAS組 30 0.45±1.32 9.56±2.89

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，Hp感染與誘發(fā)CU或加重其臨床癥狀的原因可能與以下因素有關：①Hp可誘導肥大細胞和嗜堿性粒細胞組胺等活性物質的釋放；②Hp局部的定植及由此引起的慢性炎癥參與了全身性免疫過程，通過產(chǎn)生各種介質和細胞因子放大皮膚炎癥反應；③Hp感染使胃腸黏膜屏障受到破壞，致進入腸道的抗原或其他促炎癥因子更易吸收并暴露于免疫系統(tǒng)而誘發(fā)或加重慢性蕁麻疹，且確有部分Hp抗體陽性的CU患者經(jīng)抗Hp治療后，其CU的病情得到改善[4]。前期研究顯示Hp感染可能是誘發(fā)CU或加重的誘因[5]，故我們通過檢測Hp感染后小鼠模型胃黏膜肥大細胞脫顆粒的情況來進一步佐證二者之間的關系。

文獻報道人群中Hp的感染率為50%左右，CU患者合并Hp感染的幾率較高，但并非所有感染了Hp的患者都會出現(xiàn)慢性蕁麻疹的癥狀，這種現(xiàn)象可能是由于Hp菌株的不同和毒力大小差異引起[6]。細胞空泡毒力（vaculatingcytotoxin，VacA）是Hp的主要毒力因子[7]，而其在CU中的作用目前國內(nèi)外研究很少。在本研究中我們選取了高毒力（VacA+ CagA+）和低毒力（VacA- CagA+）Hp菌株，探討細胞空泡毒力不同Hp菌株對動物模型胃粘膜肥大細胞（mast cell，MC）脫顆粒的影響，從而探討Hp感染后CU的發(fā)生與否或病情的嚴重程度與Hp的分型是否存在一定關系。我們的前期研究曾發(fā)現(xiàn)Hp（VacA+ CagA+）感染小鼠模型胃粘膜內(nèi)MC總數(shù)、脫顆粒MC總數(shù)及脫顆粒MC百分比均明顯高于對照組，鏡下可見胃粘膜內(nèi)MC成群、成團分布，胞膜破潰，顆粒涌出胞膜，成噴射狀瀉出，且有大量淋巴細胞、單核細胞等炎癥細胞浸潤[8]。徐克強等[9]研究發(fā)現(xiàn)Hp感染后胃粘膜中脫顆粒的MC較Hp陰性者明顯增加。國內(nèi)相關動物實驗也表明，Hp菌株粗提抗原注入SD大鼠胃壁后可顯著刺激MC的脫顆粒數(shù)，從而釋放組胺和一系列血管活性介質，引起粘膜血管的擴張及粘膜的疾病。

在本研究中我們觀察到，兩組實驗組小鼠胃黏膜內(nèi)及外周血中組胺含量升高，高毒力株所致的胃黏膜組胺含量低于低毒力株，與盧杰夫等[10]的研究結果有一定差異，他們發(fā)現(xiàn)Hp感染患者胃黏膜組胺含量較Hp陰性者降低，而外周血中組胺含量則高于Hp陰性者。分析本試驗中兩組實驗組小鼠外周血組胺含量差異不明顯，可能與組胺代謝速度快，通常在1～2min就被甲基轉移酶和聯(lián)胺氧化酶快速代謝有關[11,12]，故在外周血中未檢測到較高的組胺含量。活化的肥大細胞分泌顆粒中除組胺外，還包括一些蛋白水解酶，比如類胰蛋白酶，以往的研究大多是是通過定位顆粒內(nèi)的組胺來定位肥大細胞。事實上，在過敏性疾病中，類胰蛋白酶和組胺都參與反應，而類胰蛋白酶的升高通常在發(fā)病30min后才能被檢測到，1～2h達到峰值，半衰期為90min，其免疫活性穩(wěn)定，更能為過敏性疾病提供有價值的診斷依據(jù)。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，兩組實驗組小鼠外周血及胃黏膜中類胰蛋白酶含量高于對照組；高毒力組小鼠胃黏膜類胰蛋白酶含量低于低毒力組，但外周血中類胰蛋白酶含量卻高于低毒力組，這可能與胃黏膜產(chǎn)生的類胰蛋白酶大量釋放到外周血中有關。結果提示，Hp感染時胃黏膜中肥大細胞釋放大量活性物質入血，故感染部位的組胺、類胰蛋白酶含量降低，外周血中含量增加，而釋放到外周血中的這兩種物質可以進一步誘發(fā)或加重CU。在本試驗中我們發(fā)現(xiàn)，高毒力Hp菌株更能誘導肥大細胞脫顆粒，釋放大量的活性物質入血，介導強烈的過敏和炎癥反應。

組胺和類胰蛋白酶作為MC脫顆粒的標志，目前國內(nèi)外已有所研究。血漿中的組胺既可來源于組織中MC，也可來源于血中的嗜堿粒細胞，血漿組胺水平實際上反映這兩種細胞的激活狀態(tài)和數(shù)目。類胰蛋白酶作為MC活化后釋放的另一種活性物質，在嗜堿粒細胞中含量很低，所以體液中類胰蛋白酶濃度升高被視為MC激活和MC介導疾病的標志[3]。此外，類胰蛋白酶還可刺激人MC脫顆粒[13]，放大MC的效應。故對類胰蛋白酶的測定是否較組胺更利于MC的定位還需進一步的研究證明。

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Discussion of pathogenic mechanism of chronic urticaria induced or aggravated by Helicobacter pylori

LV Jing，LI Yan-xi，XUE Mei，et al
Department of Dermatology, the First People’s Hospital, Chongqing 400011, China

Objective To investigate the changings of histamine and tryptase in BALB/c mice's peripheral blood and gastric mucosal induced by Helicobacter pylori(Hp), therefore to establish the importance role of Hp in the course of chronic urticaria (CU). Methods 90 BALB/c healthy mice were randomized into3 different groups: experimental group1(EG1) experimental group2(EG2)and control group(CG), each group including 30 mice. EG1 and EG2 were given high-toxicity Hp liquid and low-toxicity Hp liquid separatively. CG were given BAS2%. A method for the fluorometric assay of histamine was used to determine the histamine concentration in both the blood and the gastric mucosal of these mice. Tryptase concentration was determined by inmmunohistochemistry and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) in EG and CG. ResultsIn EG (including VacA+ and VacA- group), the histamine concentration in both the blood and the gastric mucosal were higher than those in CG (P＜0.01); in high-toxicity group, the histamine concentration in gastric mucosal was lower than that in low- toxicity group (P＜0.01), however, there was no significant statistical difference between the histamine concentration in blood (P＞0.01). In EG, the tryptase concentration in both the blood and the gastric mucosal were higher than those in CG (P＜0.01); in high- toxicity group, the tryptase concentration was lower than that in low- toxicity group (P＜0.01), but it was higher in blood (P＜0.01). Conclusion The concentration of histamine and tryptase in BALB/c mice, peripheral blood and gastric mucosal both increased because of Hp. This may be an important cause of inducing or aggravating of CU.

Helicobacter pylori；Chronic urticaria；Toxicity；Histamine；Tryptase

R758.24

A

1674-1293(2011)01-0012-04

呂 靜

2010-10-25

2011-01-08)

（本文編輯 祝賀）

重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學科研基金資助項目（項目編號：2010-2-239）

400011，重慶市第一人民醫(yī)院皮膚科（呂靜，李彥希，薛梅，柯丹）

呂靜，女，醫(yī)師，研究方向：變態(tài)反應性疾病及化妝品相關皮膚病，E-mail:lvjing_0315@yahoo.com.cn