崔竹梅，黃海珊，秦歡歡，樸金苗，齊 斌

馬鈴薯蛋白組分的分離提取和功能性質(zhì)研究

崔竹梅，黃海珊，秦歡歡，樸金苗，齊 斌*

(常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500)

采用透析與等電點(diǎn)沉淀相結(jié)合的工藝方法提取分離馬鈴薯塊莖蛋白組分；并對(duì)其理化性質(zhì)和功能性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：此提取工藝流程合理易行，馬鈴薯塊莖酸性蛋白組分和堿性蛋白組分的得率分別為0.535%、0.741%；純度分別為92.5%、89.2%；酸性蛋白組分沉降系數(shù)5S，分子質(zhì)量82kD；堿性性蛋白組分沉降系數(shù)8S，分子質(zhì)量140kD。SDS-PAGE電泳圖譜表明5S蛋白組分有1條亞基帶；8S蛋白組分有4條亞基帶。5S蛋白組分的表面疏水性、吸油能力、乳化性顯著高于8S蛋白組分；而8S蛋白組分的總巰基含量以及起泡性高于5S蛋白組分。馬鈴薯蛋白組分可以作為功能食品的蛋白添加原料。

馬鈴薯蛋白；提取分離；功能性質(zhì)

植物性蛋白對(duì)于人類營(yíng)養(yǎng)具有重要意義。馬鈴薯資源豐富，我國(guó)年產(chǎn)量約6000萬(wàn)t，居世界前列，但加工量只占總產(chǎn)量的10%左右。目前對(duì)馬鈴薯的研究主要集中在糖蛋白patatin、蛋白酶抑制劑和低分子質(zhì)量抗菌肽等的生理作用[1-4]。而馬鈴薯蛋白多被作為淀粉生產(chǎn)過(guò)程中的廢料成分，食品利用較少。馬鈴薯貯藏蛋白主要分為酸性組分和堿性組分，前者主要成分為糖蛋白patatin，后者主要成分是20～24kD 蛋白酶抑制劑和多肽。

關(guān)于馬鈴薯濃縮蛋白和分離蛋白的制備[5-8]、純化[9-11]及功能性質(zhì)[12-13]研究較多，而對(duì)酸性蛋白組分和堿性蛋白組分的分離提取研究較少。Ralet等[14]采用離子交換層析法獲得了酸性和堿性蛋白組分，并對(duì)它們的溶解性、熱穩(wěn)定性和乳化性等部分性質(zhì)做了研究。此法制備的馬鈴薯蛋白組分的純度較高，但成本高、得率低，不適用于規(guī)模生產(chǎn)。

馬鈴薯蛋白營(yíng)養(yǎng)均衡，是極具潛力的食品蛋白來(lái)源。目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)馬鈴薯酸性蛋白組分和堿性蛋白組分同時(shí)分離提取的工藝流程以及沉降系數(shù)、表面疏水性等性質(zhì)的研究報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行研究，以期可提高馬鈴薯的產(chǎn)品附加值和綜合利用率，解決馬鈴薯加工廠淀粉廢液直接排放的污染問(wèn)題，同時(shí)為馬鈴薯蛋白的深入研究及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮馬鈴薯 市售。

三(羥甲基)氨基甲烷(T r i s)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、丙烯酰胺(Acr)、亞硫酸氫鈉(SBS)、過(guò)硫酸氨(AP)、四甲基乙二氨(TEMED)、1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS)、苯甲基磺酰氟(PMSF) 美國(guó)Sigma公司；其他所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Delta 320型精密pH計(jì) 瑞士Mettler Toledo公司；AOLPHA 1-2LD Plus型冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；電泳儀、MilliQ超純水裝置 美國(guó)Bio-Rad公司；Prote.o.meLab XL-Ⅰ分析型超速離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；AKTA primplus液相色譜系統(tǒng)液相系統(tǒng) GEAmersham公司；RF - 5301PC熒光分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 馬鈴薯塊莖總蛋白的提取

總蛋白的提取參照文獻(xiàn)[12]并做修改。

新鮮馬鈴薯切成片，加少量0.5g/100mL的Na2SO3溶液打成勻漿，濾去薯渣后6000r/min離心10min。調(diào)節(jié)上清液至pH4.0，離心取沉淀。將沉淀調(diào)節(jié)至pH7.0，凍干得粗蛋白粉。

1.3.2 馬鈴薯蛋白組分的分離工藝流程

將馬鈴薯粗蛋白粉用10g/100mL NaCl溶液溶解，8000r/min離心20min。取上清液透析36h，4 ℃、5000r/min離心20min，所得沉淀凍干得馬鈴薯堿性蛋白組分。再調(diào)節(jié)離心所得上清液至pH4.0，4℃、8000r/min離心20min，所得沉淀為馬鈴薯酸性蛋白，調(diào)節(jié)至pH7.0，凍干備用。具體操作流程見(jiàn)圖1。

1.3.3 馬鈴薯蛋白組分理化性質(zhì)

1.3.3.1 蛋白得率和純度的測(cè)定

蛋白質(zhì)濃度測(cè)定：采用Brandford法；總蛋白質(zhì)含量：采用微量凱氏定氮法(N×6.25)。

微量凱氏定氮法測(cè)定總蛋白的純度；SDS-PAGE電泳測(cè)定各蛋白組分的純度，SDS-PAGE采用不連續(xù)垂直板狀凝膠電泳，凝膠厚度1mm，濃縮膠5%，分離膠12%，凝膠分析用Bio-Rad公司的Quatity-One軟件。

1.3.3.2 蛋..白純化和沉降系數(shù)的測(cè)定

采用AKTA primplus液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行蛋白純化(裝seperdex75 10/300GL柱)。1mL樣液上樣，洗脫液的Tris-HCl(0.1mol/L，pH 7.5)，洗脫流速0.8mL/min。測(cè)沉降系數(shù)的測(cè)定，參見(jiàn)Wolf法[15]。

1.3.4 馬鈴薯蛋白組分食品功能性質(zhì)

1.3.4.1 表面疏水性的測(cè)定

表面疏水性測(cè)定，采用熒光探針ANS法[16]，略有改動(dòng)。用0.01mol/L pH 7.0緩沖液配制不同質(zhì)量濃度的蛋白質(zhì)溶液(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL)和8.0mmol/L的1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS)溶液。檢測(cè)前取20μL ANS溶液加到4mL蛋白質(zhì)溶液中，混合均勻，迅速測(cè)定混合液的熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長(zhǎng)為390nm，發(fā)射波長(zhǎng)為470nm。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，曲線的斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)。

1.3.4.2 巰基含量測(cè)定

參照Kachanechaia等[17]的方法測(cè)定巰基含量。取蛋白樣品60mg溶于10mL Tris-Gly緩沖液(含0.004mol/L EDTA、8mol/L尿素，pH8.0)，10000r/min離心10min，取上清液測(cè)游離巰基(—SHF)和總巰基(—SHT)含量。

1.3.4.3 吸油性的測(cè)定

取0.5g蛋白樣品于刻度10mL離心管中，加入5mL色拉油，混勻1min，在室溫下靜置30min，然后3000r/min離心30min，測(cè)量其上清液體積，用5mL減去上清液體積即為樣品吸油量。

1.3.4.4 起泡性的測(cè)定

0.5 g樣品溶解到100mL 蒸餾水中，調(diào)節(jié)至pH7.0，然后在10000r/min 的組織搗碎勻漿機(jī)中均質(zhì)2min，記錄均質(zhì)停止時(shí)泡沫的體積。

1.3.4.5 乳化性的測(cè)定

用0.2mol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)配制0.1g/100mL的蛋白液，取45mL蛋白液與15mL大豆油于高速組織搗碎機(jī)中均質(zhì)(10000r/min)1min，制成白色乳狀液。立即從乳液底部吸取0.5mL乳濁液，加25mL SDS(0.1g/100mL)，充分混勻后在500nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度A500nm，即得：乳化活性(EAI)=A500nm×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯塊莖蛋白的提取

經(jīng)凱氏定氮分析，實(shí)驗(yàn)所用馬鈴薯塊莖蛋白含量為1.97%(以鮮質(zhì)量計(jì))。采用Na2SO3水溶液浸提法的蛋白得率低于FeCl3沉淀法[7]，但水提法簡(jiǎn)單無(wú)毒，適用于食品生產(chǎn)。

馬鈴薯蛋白酸性組分在pH4時(shí)溶解性較小，而堿性蛋白組分的在整個(gè)pH值范圍內(nèi)溶解度都較高，所以不能用堿溶酸沉法分離馬鈴薯酸性、堿性蛋白組分。但兩者在鹽溶液中的溶解性有所不同，堿性蛋白組分在純水中的溶解性明顯低于鹽溶液，可通過(guò)稀釋蛋白鹽溶液或透析法使堿性蛋白組分析出。采用透析和等電點(diǎn)沉淀相結(jié)合的工藝流程制備馬鈴薯酸性和堿性蛋白組分，獲得了較理想的得率，酸性蛋白為0.535%，堿性蛋白為0.741%(表1)。

表1 馬鈴薯蛋白的得率和純度Table 1 Yield and purity of potato tuber protein fractions

如用馬鈴薯粗蛋白粉為對(duì)照，則酸性蛋白的得率為37.7%，堿性蛋白為52.2%。酸性蛋白蛋白得率低，但純度較高，達(dá)到92.5%；而堿性蛋白的純度略低，為89.2%。同時(shí)本工藝流程簡(jiǎn)單可行，無(wú)外來(lái)污染物的引入，在工業(yè)生產(chǎn)中可以用超濾技術(shù)取代透析過(guò)程，提高生產(chǎn)效率。

2.2 馬鈴薯蛋白組分沉降系數(shù)的測(cè)定

圖2 馬鈴薯酸性蛋白沉降系數(shù)Fig.2 Sedimentation coefficient of the acid protein fraction from potato tuber

圖3 馬鈴薯堿性蛋白沉降系數(shù)Fig.3 Sedimentation coefficient of the alkaline protein fraction from potato tube

馬鈴薯塊莖蛋白酸性組分和堿性組分的沉降系數(shù)和分子質(zhì)量的研究未見(jiàn)報(bào)道。蛋白組分經(jīng)脫鹽純化后進(jìn)行超速離心，由圖2可知，酸性蛋白組分的沉降系數(shù)為5S，堿性蛋白組分沉降系數(shù)為8S；它們的分子質(zhì)量分別為82、140kD。

2.3 馬鈴薯蛋白組分的SDS-PAGE電泳圖譜

SDS - PAGE已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)分析測(cè)定，要獲得較好的SDS - PAGE 電泳分辨率，電泳條帶應(yīng)分布在膠的中央，且條帶分布清晰。預(yù)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)采用5%的濃縮膠，12%的分離膠濃度進(jìn)行馬鈴薯蛋白SDSPAGE電泳效果最佳。

圖4為馬鈴薯總蛋白的電泳圖譜，從圖譜上可以看出馬鈴薯蛋白條帶分布均勻，出現(xiàn)13條分布清晰的亞基條帶，比Partsia等[5]研究認(rèn)為的5條亞基帶要多。馬鈴薯塊莖蛋白電泳圖譜可分成兩個(gè)集中區(qū)域，上方區(qū)域中有分子質(zhì)量為60、41kD 的兩條主帶；下方區(qū)域中出現(xiàn)4個(gè)主帶，分子質(zhì)量分別為16、22、23、25kD。馬鈴薯酸性蛋白主要為41kD蛋白(圖5)，即糖蛋白patatin。patatin 為二聚體蛋白，其總分子質(zhì)量約為82kD，與2.2節(jié)中超速離心分析所得結(jié)果一致。堿性蛋白組分主要是16～25kD 的蛋白酶抑制劑和多肽。

圖4 馬鈴薯總蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE patterns of potato total protein

圖5 馬鈴薯酸性蛋白、堿性蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.5 SDS-PAGE patterns of the acid and alkaline protein fraction of potato tuber

2.4 馬鈴薯塊莖酸性蛋白和堿性蛋白理化性質(zhì)研究

疏水相互作用對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、構(gòu)象和功能具有重要意義，是維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)最重要的作用力。熒光探針ANS法是一種經(jīng)典的評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)表面疏水性的方法。蛋白質(zhì)的疏水性，與其表觀作用如表面張力、乳化性能等具有很好的相關(guān)性。二硫鍵是天然存在于蛋白質(zhì)中唯一的側(cè)鏈交聯(lián)共價(jià)鍵，在單體蛋白質(zhì)中，二硫鍵的形成是蛋白質(zhì)折疊的結(jié)果，二硫鍵含量的多少會(huì)影響蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性和凝膠性。蛋白質(zhì)表面疏水性以及游離巰基含量的變化，直接影響其溶解性、起泡性和乳化性等功能特性。

表2 5S和8S蛋白組分的表面疏水性和巰基含量Table 2 Surface hydrophobicity and sulfhydryl content of isolated 5S and 8S fractions of potato storage proteins

Ellman’s試劑檢測(cè)3種蛋白質(zhì)，由表2可知，8S蛋白中的巰基總含量和二硫鍵顯著高于5S蛋白；同時(shí)8S組分的表面疏水性比5S 的要小得多，這可能與其含有更多的二硫鍵有關(guān)，二硫鍵使蛋白質(zhì)肽鏈的空間結(jié)構(gòu)更為緊密，把蛋白質(zhì)的疏水端包裹在分子內(nèi)部。其他導(dǎo)致8S 組分表面疏水性較小的原因?qū)⒃诤罄m(xù)實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)研究。

由表3可知，馬鈴薯蛋白具有良好的食品功能性質(zhì)，與大豆分離蛋白相關(guān)指標(biāo)[18]接近，比報(bào)道的甘薯蛋白的指標(biāo)[19]略低。馬鈴薯5S組分具有良好的吸油能力、乳化性，可考慮應(yīng)用于脂肪含量較高的食品如肉制品、乳制品等。馬鈴薯蛋白5S組分的起泡性卻顯著低于8S蛋白組分，8S 組分的起泡性達(dá)到了1.85mL/g。蛋白質(zhì)的乳化性質(zhì)與其表面疏水性存在弱的正相關(guān)[20]，同時(shí)蛋白質(zhì)的高溶解度也是良好的起泡能力的先決條件。

表3 5S和8S蛋白組分的功能性質(zhì)Table 3 Functional characterizations of the isolated 5S and 8S fractions of potato proteins

3 結(jié) 論

馬鈴薯蛋白營(yíng)養(yǎng)均衡，其貯藏蛋白組分可分成酸性蛋白組分和堿性蛋白組分，研究其蛋白提取工藝和功能性質(zhì)有其實(shí)際意義。本實(shí)驗(yàn)得出以下結(jié)論：

通過(guò)透析和等電點(diǎn)沉淀法結(jié)合的工藝流程來(lái)分離提取馬鈴薯塊莖酸性和堿性蛋白組分，得率達(dá)到了0.535%、0.741%，純度達(dá)到了92.5%、89.2%。 可進(jìn)一步優(yōu)化工藝流程，提高各蛋白組分的得率。

馬鈴薯蛋白酸性和堿性組分的沉降系數(shù)分別為5S、8S，分子質(zhì)量分別為82、140kD。SDS-PAGE 圖譜顯示5S蛋白組分有1條亞基帶，分子質(zhì)量41kD；8S蛋白組分有4條主帶，分子質(zhì)量16～25kD。

5S蛋白組分的表面疏水性、吸油性、乳化性高于8S蛋白；而8S 蛋白組分的性巰基含量、起泡性明顯高于5S蛋白組分?？筛鶕?jù)它們的功能特點(diǎn)，在食品中進(jìn)行添加應(yīng)用的研究。

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Isolation and Characterization of Potato Protein Fractions

CUI Zhu-mei，HUANG Hai-shan，QIN Huan-huan，PIAO Jin-miao，QI Bin*
( College of Biology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China)

Potato protein fractions was isolated by combing dialysis and isoelectric precipitation, and their partial physicochemical and functional properties were determined. The results showed that the isolation procedure was feasible, with the acid and alkaline protein fraction of potato tuber accounting for 0.535% and 0.741%, respectively, and their purity were 92.5% and 89.2%, respectively. The acid protein fraction , s sedimentation coefficient was 5S, consisting principally of one subunit band with apparent MW41 kD. The alkline protein fraction ,s sedimentation coefficient was 8S, with 4 subunit bands detected in the SDSPAGE pattern, and apparent MW 25, 23, 22 kD and 16 kD, respectively. The 5S fraction showed greater surface hydrophobicity, fat absorption, and emulsifying capacity, while lower sulfhydryl content, foaming capacity. The 8S fraction showed greater sulfhydryl content and foaming capacity than 5S fraction. The protein fractions of potato were the best choice for functional foods.

potato protein；isolation；functional properties

TS201.21

A

1002-6630(2011)03-0076-05

2010-05-24

崔竹梅(1977-)，女，博士研究生，研究方向?yàn)榧Z食油脂與植物蛋白工程。E-mail：zhumeicui0623@yahoo.cn

*通信作者：齊斌(1965-)，男，教授，博士，研究方向?yàn)榧Z食油脂與植物蛋白工程。 E-mail：qibin65@126.com