鄒林洪綜述,王豫蓉審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸科 400015)

樹突狀細胞(dendritic cell,DC)由Steinman和Cohn[1]于1973年首次在小鼠脾淋巴結(jié)中分離出來,因在體內(nèi)成熟時細胞表面伸出樹突樣或偽足樣突起而得名,是目前已知的專職抗原提呈細胞[2],能夠激活初始T細胞。有研究表明DC在免疫應(yīng)答中起著關(guān)鍵作用[3],在移植免疫中起著雙向作用。一方面,DC向受體T細胞提呈供體抗原以及激活信號,誘導(dǎo)排斥反應(yīng)的發(fā)生;另一方面,某些DC具有免疫調(diào)節(jié)作用,誘導(dǎo)機體對自體和外來抗原免疫耐受的發(fā)生。因此,利用DC的免疫調(diào)節(jié)作用誘導(dǎo)特異性的免疫耐受已成為當前移植領(lǐng)域的研究熱點之一。Steinman和Banchereau[4]研究表明DC的免疫功能與細胞成熟與否有關(guān),成熟DC啟動免疫排斥反應(yīng),未成熟DC誘導(dǎo)免疫耐受。DC存在體內(nèi)的部位較多,但數(shù)量有限,目前尚不能直接從組織中大量分離獲得,需要進行培養(yǎng)擴增并純化才能滿足應(yīng)用的需要。因此,如何培養(yǎng)獲得大量且純度更高的DC是進行各種研究的前提,是目前研究的重點之一。

目前,已能利用小鼠、大鼠和人的多種組織進行DC的體外培養(yǎng),在基礎(chǔ)實驗中以小鼠和大鼠DC的培養(yǎng)研究最常見?，F(xiàn)將對DC體外培養(yǎng)的取材來源、培養(yǎng)方法、鑒定方法及在器官移植中應(yīng)用的研究進展綜述如下。

1 DC培養(yǎng)的取材來源

1.1 小鼠

1.1.1 骨髓 最早開始用于體外培養(yǎng)DC的動物是小鼠。DC是由骨髓干細胞分化而來,因而用于培養(yǎng)小鼠DC的組織來源主要是骨髓,也是目前動物體外培養(yǎng)DC最常見的來源。骨髓中含有大量的CD34+造血干細胞,可在細胞因子的刺激下誘導(dǎo)產(chǎn)生一定數(shù)量及質(zhì)量的DC。常采用的方法是取出小鼠四肢的股骨和脛骨[5],用RPMI-1640培養(yǎng)基沖洗出骨髓腔內(nèi)的骨髓及髓內(nèi)細胞,分離得到CD34+造血干細胞后進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.1.2 脾臟 1973年DC首次由 Steinman和Cohn[1]從小鼠脾臟中分離而來。他們先利用酶消化脾臟,再通過梯度密度離心過濾懸浮細胞,經(jīng)過短時間貼壁后,培養(yǎng)過夜進行分離,可以得到一定數(shù)量的DC。Yao等[6]將小鼠脾臟消化培養(yǎng)獲得了大于90%純度和95%生存能力的DC。Huber等[7]也用小鼠脾臟成功培養(yǎng)出DC。

1.1.3 淋巴結(jié) 從各種淋巴結(jié)收集培養(yǎng)DC是另外一個獲得DC有效的方法,Clare-Salzler和Mullen[8]將小鼠斷頸處死,將淋巴結(jié)無菌分離,切碎制備細胞懸浮液,再進行分離培養(yǎng),可以獲得大量70%～90%純度的DC。胰腺淋巴結(jié)(PLN)、腘窩引流淋巴結(jié)(PO-LNs)[9]、腸系膜淋巴結(jié)[10]均是小鼠DC培養(yǎng)的重要來源。

1.2 大鼠

1.2.1 骨髓 骨髓來源的DC是大鼠DC培養(yǎng)研究的重要途徑。1982年Klinkert等[11]首次利用伴刀豆球蛋白A處理的脾細胞上清液來刺激低密度的大鼠骨髓前體細胞而獲得大鼠骨髓來源的DC。此后,不斷有研究報道成功從骨髓細胞培養(yǎng)獲取大鼠骨髓來源DC,但是產(chǎn)量均較低。隨著研究的深入,在利用重組大鼠GM-CSF的基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用重組大鼠IL-4和IL-10等細胞因子,使大鼠骨髓來源的DC的產(chǎn)量有了顯著提高,現(xiàn)在每只大鼠可獲得具有典型特征的 DC約1×107個,采用免疫分選法可使其純度達90%以上。在實驗研究中,其骨髓采集容易,易于培養(yǎng)、擴增,費用相對便宜。因此,從大鼠骨髓中分離誘導(dǎo)培養(yǎng)DC是許多學(xué)者主要的選擇方法。

1.2.2 脾臟 脾臟是一個重要的免疫器官,DC在脾臟中參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[12]。大鼠脾臟來源DC的收集培養(yǎng)同小鼠一樣也多采取消化過濾的方法[13],可獲得較高純度的DC。大鼠的脾臟DC可以分為3種形態(tài)和表型不同的亞型:CD4+、CD4-、類漿細胞[14]。最近研究表明未培養(yǎng)過夜而分離的脾臟DC較按常規(guī)方法培養(yǎng)的DC表現(xiàn)出更多未成熟DC的典型特征[15]。

1.2.3 淋巴結(jié) Matsuno等[16]直接通過周圍淋巴結(jié)或中樞淋巴管收集DC,是在最接近生理條件狀況下收集得到80%～90%純度的DC,其生存能力達到95%以上,更具備DC本身的活性。

1.2.4 外周血 有研究指出DC的含量在大鼠外周血中小于0.1%[17],大鼠外周血DC的培養(yǎng)一般是采取大鼠的髂外靜脈血進行培養(yǎng)。有報道指出臍帶血和外周血來源的DC不能用于免疫正常動物的體內(nèi)研究,而只能用于免疫缺陷動物的體內(nèi)研究[18]。因而有學(xué)者建議用外周血來源的DC進行免疫缺陷的治療,但這一特性也縮小了對外周血來源DC研究應(yīng)用的范圍。

1.3 人類

1.3.1 臍帶血 臍帶血是DC體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的一個重要來源,是目前DC培養(yǎng)研究的熱點之一[19-20]。臍帶血一般用于對人類DC培養(yǎng)的相關(guān)研究[21]。臍帶血中含有較多的CD34+造血干細胞,其來源廣泛,培養(yǎng)相對方便,具有較好的組織相容性。常采取新生胎兒臍帶血,離心后加入細胞因子定向誘導(dǎo)DC的生成。

1.3.2 外周血 大量的基礎(chǔ)研究證實通過細胞因子可以將人類外周血單個核細胞進行分離誘導(dǎo)培養(yǎng)出DC[22]。外周血來源廣泛,采集方法簡單、方便,不易污染。但此方法存在以下缺點:(1)外周血中DC量相對骨髓中較少;(2)對實驗人員的技術(shù)操作要求高,操作步驟相對較復(fù)雜,容易造成DC分離不純、丟棄過多或混入較多的雜質(zhì)。

2 DC的分離及培養(yǎng)方法

2.1 培養(yǎng)DC常用細胞因子的種類 目前用來誘導(dǎo)培養(yǎng)DC的細胞因子主要有粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細胞介素-10(IL-10)、白細胞介素-4(IL-4)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、γ干擾素(IFN-γ)、核因子-κ B(NF-κ B)圈套寡核苷酸,脂多糖(LPS)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)等。細胞因子的單獨或幾種聯(lián)合使用誘導(dǎo)擴增DC、是最常用的方法。其中GMCSF是最基本、最重要的細胞因子[23],有研究指出單獨使用低劑量的GM-CSF即可以培養(yǎng)出未成熟的DC。根據(jù)培養(yǎng)要求的不同常在使用GM-CSF的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他細胞因子進行培養(yǎng),如 LPS、TNF-α、IFN-γ是比較常用的促DC 成熟的細胞因子,而 IL-4[24]、IL-10[25]、TGF-β[26]和 NF-κ B 圈套寡核苷酸則能抑制中性粒細胞和巨噬細胞等促炎性細胞因子的產(chǎn)生,維持DC處于未成熟狀態(tài)。其中經(jīng)IL-10處理的DC可致T細胞無能或凋亡,有報道稱這些細胞可引起Th1向Th2的免疫偏離,TGF-β則不僅抑制DC成熟,還可增加DC的產(chǎn)量。這些細胞因子對DC的作用機制比較復(fù)雜,其效果與培養(yǎng)DC的組織來源和培養(yǎng)方法有密切的關(guān)系。

2.2 分離DC的方法

2.2.1 物理方法 亦稱“培養(yǎng)黏附法”,是根據(jù)DC和單核細胞的黏附性、密度大小等的不同進行分離[15],培養(yǎng)一定時間后收集懸浮的細胞即為DC,DC純度達60%～80%。由于“培養(yǎng)黏附法”方法簡單,價格便宜,是目前最常用的獲取DC的方法。“培養(yǎng)黏附法”最主要缺點是收集的DC常出現(xiàn)抗原標志的改變,容易造成部分DC前體細胞的丟失從而使產(chǎn)量減少,且純度尚有待進一步提高。

2.2.2 免疫分選法 亦稱“單抗法”,包括流式細胞術(shù)、磁性細胞分離術(shù)等,是以密度梯度離心法[27]配合以免疫磁珠清除法[28]或流式細胞術(shù)法,此法培養(yǎng)出的DC純度可達90%以上?！皢慰狗ā狈蛛x純度高,可保持DC原有特征,一些要求較高的實驗研究中常用“單抗法”來獲取DC,但單抗消耗量大,價格昂貴,如果單抗選用不當,很容易造成部分DC丟失。

2.3 DC的培養(yǎng)方法 最常見的是先將DC的前體細胞分離出來,然后再在細胞因子的作用下誘導(dǎo)分化成為DC[21],但是這種方法由于受到前體細胞數(shù)量的限制,分離得到的DC數(shù)量有限。因此,有學(xué)者先對干細胞進行擴增后再誘導(dǎo)分化成DC。對臍帶血通常采取“兩步法”,首先選擇重組人卵泡抑素(FST)、IL-3、IL-7、IL-13等從臍帶血中將 CD34+造血干細胞中分離出,并將CD34+造血干細胞擴增至一定數(shù)量,然后再選擇適當?shù)募毎蜃尤缬肎M-CSF、IL-4等誘導(dǎo)培養(yǎng)[29-30],最終培育出大量成熟的或未成熟的DC。李紀鵬等[31]先利用CD34抗體將骨髓中CD34+細胞進行分離純化及傳代擴增,至第4代時加入GM-CSF、IL-4等誘導(dǎo)骨髓CD34+細胞向 DC分化,從而獲得大量DC細胞。

3 DC的鑒定方法

3.1 DC形態(tài)學(xué)鑒定 (1)倒置相差顯微鏡下觀察:根據(jù)培養(yǎng)方法的不同,培養(yǎng)后的細胞逐漸出現(xiàn)細胞集落,大部分貼壁,細胞逐漸增大而不規(guī)則,有樹枝狀的突起伸出,呈現(xiàn)出未成熟DC的特點。隨著培養(yǎng)時間的延長細胞逐漸成熟,細胞從集落中釋放出來,細胞呈懸浮或半貼壁生長,偽足逐漸生長,分叉逐漸增多[32]。(2)掃描電鏡觀察:根據(jù)培養(yǎng)方法及培養(yǎng)階段的不同,主要表現(xiàn)為細胞形態(tài)不規(guī)則,表面粗糙,有皺褶和不規(guī)則突起,胞質(zhì)內(nèi)可見吞飲泡以及多泡體等特點。

3.2 DC表面特異性標記物鑒定 流式細胞學(xué)是目前應(yīng)用最廣泛的細胞鑒定術(shù),DC的表型鑒定主要用流式細胞學(xué)進行分析。小鼠的表面特異性標志物主要是CD11c和共刺激因子MHC-Ⅱ、CD80、CD86等。大鼠的表面特殊標記物較少,目前較多的主要有 OX6、OX62和共刺激因子 MHC-Ⅱ、CD40、CD54、CD80、CD86等[33]。隨著對大鼠DC生物學(xué)特性的深入研究發(fā)現(xiàn),大鼠DC的表面標記物OX62的表達率高于OX6,因而近年來越來越多的學(xué)者將OX62作為表面特異性標記物來對大鼠DC進行研究。共刺激因子CD80、CD86、MHC-Ⅱ等表達的高低主要反應(yīng)DC成熟度的高低,其表達越高說明DC細胞成熟度越高。

3.3 功能學(xué)鑒定 混合淋巴細胞反應(yīng)是目前檢測DC抗原提呈能力的重要方法,通過四甲基偶氮唑鹽法檢測混合淋巴細胞反應(yīng),計算淋巴細胞刺激指數(shù)(加刺激細胞的A值/不加刺激細胞的A值),刺激指數(shù)與DC/T細胞的比值呈正相關(guān),隨DC/T細胞的比值增大而增大[34]。

4 DC在器官移植中應(yīng)用

近年來DC的應(yīng)用得到許多學(xué)科的肯定[35],DC具有誘導(dǎo)免疫耐受的特性在誘導(dǎo)移植免疫耐受方面已經(jīng)展現(xiàn)出獨特的應(yīng)用價值,在器官移植中得到了廣泛應(yīng)用,在心臟、腎臟、肝臟、小腸、胰腺、肢體移植等的報道較多,在角膜、皮膚、動脈、性腺、胰島、喉、脾、腎上腺等器官移植中也有報道。研究結(jié)果指出將具有致耐受作用的DC輸入受體體內(nèi)能明顯減低受體的免疫排斥作用,能夠在一定程度上延長移植物或受體存活時間。

5 展 望

DC通過多種機制誘導(dǎo)免疫耐受或減輕同種異體免疫反應(yīng),在移植中展示出極強的可塑性已成為當前研究熱點。目前人們對DC的研究尚處于初級階段,現(xiàn)有實驗尚停留在動物實驗階段,許多問題如DC誘導(dǎo)耐受的具體機制尚不完全清楚,細胞的類型和劑量、輸注時間和時機、輸注的途徑等都有待進一步深入研究。提取高純度的DC是進行各項研究的基礎(chǔ),雖然目前已能在體外培養(yǎng)并誘導(dǎo)產(chǎn)生DC,但依然存在不足,仍然有許多問題需要進行更深層次的研究。相信隨著對DC的進一步研究和細胞生物學(xué)的進一步發(fā)展,培養(yǎng)出具有致耐受作用的DC,誘導(dǎo)移植免疫耐受的目的最終是有望實現(xiàn)的。

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