汪林寶 趙 松 (鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450052)

MicroRNA(miRNA)是近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)的在自然界生物體中廣泛存在的大小 21～23 nt的一類非編碼小分子 RNA〔1,2〕,在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)編碼蛋白的 mRNA進(jìn)行調(diào)控,抑制基因表達(dá)〔3〕。盡管 miRNA的生物學(xué)作用及調(diào)控的目標(biāo)基因還沒(méi)有完全清楚,但它在細(xì)胞分化、增殖、死亡等復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程中的調(diào)控作用已經(jīng)得到證實(shí)〔4〕。特別是 miRNA家族中的 let-7在人類肺癌、結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌中低表達(dá)表明它作為抑癌miRNA參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展,并且在某些腫瘤中抑制癌基因 Ras和c-myc的表達(dá)〔5～9〕。

目前對(duì)miRNA進(jìn)行檢測(cè)的主要方法有RT-PCR、Northern印跡、cDNA arrays,它們有各自的優(yōu)缺點(diǎn),miRNA前體同miRNA成熟體的表達(dá)水平基本上是一致的〔10〕。本研究采用RTPCR法對(duì)let-7a-1前體和 K-ras在食管癌及正常食管黏膜中進(jìn)行半定量檢測(cè),初步探討其在食管癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用,為食管癌的診斷、基因治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集及處理 收集 2010年 7月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科手術(shù)切除的新鮮食管癌標(biāo)本 20例,標(biāo)本離體30min內(nèi)分離切端正常食管黏膜(距腫塊邊緣＞5cm)及癌組織,置入凍存管中液氮迅速冷凍后,放入 -80℃冰箱中保存。經(jīng)病理證實(shí) 20例癌組織中 17例為鱗癌,3例為腺癌。所有食管癌患者術(shù)前均未接受化療、放療。其中男 13例,女 7例;年齡 47～83〔平均(63.30±8.66)〕歲;中分化 16例,高分化 4例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 7例,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 13例;腫瘤分期(食管癌國(guó)際 TNM分期標(biāo)準(zhǔn)第 7版):Ⅰ期 1例,Ⅱ期 14例,Ⅲ期 5例。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 每份標(biāo)本取約 0.1 g,充分研磨后,加入 Trizol試劑(Invitrogen公司)和三氯甲烷提取 RNA,異丙醇沉淀,75%乙醇洗滌,干燥后溶入 20～30μl焦碳酸二乙酯水溶液中,所得的總 RNA用分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度。

1.2.2 cDNA合成 根據(jù) RevertAidTM第一鏈 cDNA合成試劑盒(MBI Fermentas公司)使用說(shuō)明,其中總 RNA約 1μg,Oligo(dt)18引物 1μl,逆轉(zhuǎn)錄酶 M-MuLV 1μl,總反應(yīng)體系為20μl,在 42℃,60 min逆轉(zhuǎn)錄完畢后,70℃加熱 10 min結(jié)束反應(yīng),-70℃冷凍保存或置于冰上進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng) 2×Taq PCR MasterMix試劑盒(北京天根生化科技有限公司)的產(chǎn)品組成:1 U/10μl Taq Polymerase,500μmol/L dNTP,3 mmol/L MgCl2,20 mmol/L Tris-HCl,100mmol/L KCl,其他穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑。引物由上海生工生物工程有限公司合成,引物序列見(jiàn)表 1。25μl反應(yīng)總體系含12.5μl 2×MasterMix,7μl dd H2O,let-7a-1前體和 K-ras上下游引物各 1μl,β-actin上下游引物各 1μl,1.5μl cDNA。let-7a-1前體 PCR反應(yīng)循環(huán)的設(shè)置:94℃預(yù)變性 3 min,94℃ 30 s,57℃ 30 s,72℃ 1 min,進(jìn)行 30個(gè)循環(huán)后 72℃ 延伸 5 min。K-ras PCR反應(yīng)循環(huán)的設(shè)置:94℃預(yù)變性 3 min,94℃ 30 s,60℃30 s,72℃ 1min,進(jìn)行 30個(gè)循環(huán)后 72℃延伸 5min。

表1 let-7a-1前體、K-ras和 β-actin引物序列及其片段大小

1.2.4 PCR產(chǎn)物半定量分析 反應(yīng)完畢后,取 5μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 1.5%瓊脂糖凝膠電泳,并在凝膠紫外成像儀(英國(guó)Syn-gene公司)上成像和 GeneTools分析軟件上測(cè)定分析,以目的基因和內(nèi)參條帶的比值作為目的基因的相對(duì)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件,計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示,組間比較采用獨(dú)立樣本配對(duì) t檢驗(yàn),相關(guān)性分析采用 Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1 Let-7a-1前體和 K-ras在食管癌及其配對(duì)癌旁組織中的表達(dá) 在瓊脂糖凝膠上可見(jiàn) 105 bp、390 bp和 696bp的條帶分別為 let-7a-1前體、k-ras和 β-actin。與正常食管黏膜相比,癌組織中 let-7a-1前體表達(dá)顯著降低(＞2倍)占 40%。癌組織中K-ras表達(dá)顯著增高(＞2倍)占 30%。經(jīng) lg轉(zhuǎn)化后 Let-7a-1前體 mRNA和K-ras mRNA的相對(duì)含量均符合正態(tài)分布,經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,let-7a-1前體在食管癌組織及配對(duì)正常黏膜組織中表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,let-7a-1前體 mRNA在食管癌組織中表達(dá)下調(diào);而K-ras在食管癌組織及配對(duì)正常黏膜組織中表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Let-7a-1前體和 K-ras在食管癌中的表達(dá)無(wú)相關(guān)性(P＞0.05)。見(jiàn)圖 1,圖 2,表 2。

表2 食管癌及正常食管黏膜中l(wèi)et-7a-1前體和K-ras的表達(dá)(±s)

表2 食管癌及正常食管黏膜中l(wèi)et-7a-1前體和K-ras的表達(dá)(±s)

與正常黏膜組比較:1)P＜0.05

組別 n Let-7a-1前體 K-ras食管癌組 20 0.288±0.4391) 0.238±0.775正常黏膜組 20 0.650±0.704 -0.050±0.943

圖1 let-7a-1前體PCR擴(kuò)增的結(jié)果

圖2 K-ras PCR擴(kuò)增的結(jié)果

2.2 Let-7a-1前體和 K-ras在食管癌中的表達(dá)與主要臨床病理特征的關(guān)系 Let-7a-1前體和K-ras的表達(dá)量與性別、年齡、腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型及 TNM分期無(wú)明顯相關(guān)性(P＞0.05)。見(jiàn)表 3。

表3 let-7a-1前體和 K-ras表達(dá)與食管癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討 論

近年來(lái),一個(gè)與細(xì)胞分化、增殖、死亡等密切相關(guān)的 miRNA逐漸進(jìn)入了腫瘤研究領(lǐng)域,miRNA作為類似癌基因和抑癌基因參與細(xì)胞增殖、凋亡和分化的調(diào)控,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。miRNA家族中研究較多的let-7最先在秀麗隱桿線蟲中被發(fā)現(xiàn),是一個(gè) 21核苷酸的 RNA分子,主要作用是促進(jìn)幼蟲向成蟲轉(zhuǎn)變〔11〕。它有 14個(gè)亞型,通常每個(gè)亞型位于不同的染色體,let-7a-1位于 9q22.3。let-7與肺癌、結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān),但 let-7在食管癌中的表達(dá)及其與臨床生物病理學(xué)特征的聯(lián)系幾乎還未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò) RT-PCR法對(duì) 20例食管癌患者的食管組織中l(wèi)et-7a-1前體及K-ras進(jìn)行半定量檢測(cè),結(jié)果顯示食管癌組織中l(wèi)et-7a-1前體顯著降低,表明它可能作為抑癌基因參與食管癌的發(fā)病過(guò)程,但與其余生物病理學(xué)特征無(wú)相關(guān)性,可能是樣本量不足造成的;K-ras在食管癌與正常食管黏膜中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明它在食管癌的發(fā)生過(guò)程不具有重要意義,這與 Jian等〔12〕研究結(jié)果相似。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示 let-7a-1前體與K-ras的表達(dá)不具有相關(guān)性,表明K-ras在食管癌中不是 let-7a-1的靶基因,而 2005年 Johnson等〔13〕發(fā)現(xiàn)人類的 3個(gè) RAS癌基因(H-ras,K-ras,N-ras)的 3′端非翻譯區(qū)含有 Let-7的互補(bǔ)配對(duì)位點(diǎn),使 Let-7能夠調(diào)節(jié)其表達(dá)。這可能是由于 miRNA與靶基因的復(fù)雜關(guān)系造成的,即不同miRNA可作用于同一靶基因,而不同的 miRNA在不同組織或細(xì)胞中的靶基因有可能不同。

對(duì)食管癌相關(guān)基因的檢測(cè)有助于食管癌的診斷、預(yù)后評(píng)估及治療。對(duì)同一腫瘤不同 miRNA的定量分析可以對(duì)腫瘤進(jìn)行分期,預(yù)測(cè)患者預(yù)后〔14〕,也為腫瘤的靶向治療提供了可能。目前應(yīng)用 miRNA治療腫瘤主要有兩個(gè)策略,一是針對(duì)腫瘤中下調(diào)的 miRNA轉(zhuǎn)染 miRNA前體以糾正 miRNA的表達(dá),如應(yīng)用let-7前體可以抑制肺癌細(xì)胞株 A549的增殖〔5,15〕,二是應(yīng)用反義核苷酸抑制上調(diào)的 miRNA,如針對(duì)miRNA-122的小分子核苷酸鏈能使小鼠血清中膽固醇的水平降低〔16,17〕。本研究初步證實(shí)let-7a-1前體在食管癌中低表達(dá),而如何安全有效地將let-7a前體導(dǎo)入到食管癌腫瘤細(xì)胞內(nèi),以及導(dǎo)入到癌細(xì)胞內(nèi)的let-7a前體對(duì)食管癌發(fā)展產(chǎn)生何種影響都亟待進(jìn)一步研究。

綜上所述,let-7a-1在食管癌中低表達(dá)引起其下游調(diào)控基因表達(dá)失調(diào),因而參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)食管癌中的 let-7a-1進(jìn)行半定量檢測(cè),因此還需要高效率的檢測(cè)方法,例如基因芯片技術(shù),以發(fā)現(xiàn)更多參與食管癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān) miRNA。相信隨著 miRNA研究的飛速進(jìn)展,必將為食管癌的診斷和治療帶來(lái)新的希望。

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