董莉娟 李 華 蔣蕊鞠 楊 蓉 龍潤?quán)l(xiāng) 白慧珠 崔萍芳 楊 婷 謝忠平

人類呼吸道合胞病毒 (hum an resp iratory virus, HRSV)是世界范圍內(nèi)嬰幼兒病毒性下呼吸道感染最重要的病原體。從 1956年M o rris等[1]首次發(fā)現(xiàn)該病毒至今,尚無有效的疫苗問世。目前,國內(nèi)外對HRSV的研究多集中在研制減毒活疫苗及亞單位疫苗。裂解型亞單位疫苗是直接裂解野毒株獲得,其免疫原性比其他型的亞單位疫苗高。HRSV的純度和得率是制備優(yōu)質(zhì)裂解疫苗的重要技術(shù)參數(shù),而純化方式對此兩個指標(biāo)產(chǎn)生直接影響。因此,我們對 HRSV不同純化方法進(jìn)行比較研究,為 HRSV裂解型亞單位疫苗的研制積累一些基礎(chǔ)資料,現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

材料與方法

1.材料:人二倍體細(xì)胞 KMB17細(xì)胞株,由本所檢定室提供。人呼吸道合胞病毒 A2株由本所病毒免疫室提供。清潔級 ICR小鼠,雌性,18～22g,由本所小動物實驗中心提供。β -丙內(nèi)酯(β-p rop iono lactone,BPL)購于A lfaAesar公司;小鼠抗 RSV F蛋白單克隆抗體購于M illipo re公司;辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG購于 KPL公司。Sepharose 4FF購于 GE公司。其他試劑皆為分析純。超速離心機為BACKMAN L-90K型;層析柱 1.6cm×30cm。

2.方法:(1)感染性效價檢測:采用微量細(xì)胞病變法,以孔內(nèi)細(xì)胞病變≥50%為陽性孔,于第 7天判定結(jié)果,具體操作按參考文獻(xiàn)進(jìn)行[2]。(2)病毒的超濾濃縮:將 HRSV收獲液以截留相對分子質(zhì)量 100kDa的濾膜包進(jìn)行 30倍超濾濃縮。(3)蔗糖密度梯度離心法純化 HRSV:超速離心機運轉(zhuǎn)至2000 r/m in時,用蠕動泵依次將 30倍 HRSV濃縮液、33%蔗糖、56%蔗糖和 0.125mo l/L PB(pH7.2)各約 500m l、540m l、750m l和 100m l注入?yún)^(qū)帶轉(zhuǎn)頭,4℃、25000 r/m in離心 3h。離心結(jié)束后,當(dāng)超速離心機轉(zhuǎn)速降至 2000 r/m in時,在紫外檢測儀 280nm下收集樣品,每個組分約 100m l。按照文獻(xiàn)[3,4]的方法,用 PEG-6000將所收集的病毒進(jìn)行約 30倍濃縮。(4)Sepharose 4FF凝膠過濾層析純化 HRSV:根據(jù)目的病毒的相對分子質(zhì)量以 Sepharose 4FF凝膠作為層析介質(zhì),使用0.02mo l/L PBS(pH 7.4)以 1.7m l/m in流速平衡層析柱后,取30倍濃縮的 HRSV 1m l上樣,再以 0.02mo l/L PBS以 1.7m l/ m in流速洗脫,在 280nm下同步紫外檢測、分部收集樣品[5]。(5)純化產(chǎn)物的鑒定:使用W estern b lot鑒別純化產(chǎn)物的特異性。蛋白經(jīng)過 10%SDS-PAGE分離后,半干轉(zhuǎn)印至 PDVF膜上,以 5%脫脂奶粉 37℃封閉 1h后,加一抗 (小鼠抗 HRSV F蛋白單克隆抗體 1∶200)4℃過夜、加二抗 (HRP-羊抗鼠 IgG抗體偶聯(lián)物 1∶500)37℃反應(yīng) 1h,DAB顯色。(6)免疫原性評價:純化病毒以 1∶4000的比例加入 38%的甲醛,于 37℃放置3天,或以1∶4000的比例加入β-丙內(nèi)酯,于 2～8℃放置 7天,滅活病毒[6]。將滅活病毒加或不加 A l(OH)3制備成實驗性疫苗。選取 ICR小鼠 45只,隨機分為 9組,每組 5只。對照組每只腹腔注射 0.5m l生理鹽水;實驗組每只腹腔注射實驗性疫苗 0.5m l、28天加強 1次,分別于初次免疫后 28天、加強后 7天眼球采血分離血清,檢測中和抗體效價。(7)血清中和抗體效價檢測:采用固定病毒稀釋血清的微量中和試驗法來檢測血清中和抗體效價。待測血清 56℃滅活 30m in后,做 2倍系列稀釋,每稀釋度 50微升/孔,再加入 2000 CC ID50/m l病毒 50微升 /孔,混勻,37℃中和 1h后,加入 1×106/m l濃度的KMB17細(xì)胞 100微升/孔。置 37℃、4%CO2孵箱中培養(yǎng)。同時設(shè)置病毒對照、細(xì)胞對照和陰性血清對照。于第 7天判定結(jié)果。以抗體效價≥1∶4為陽性。(8)統(tǒng)計分析:使用 SPSS12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。

結(jié) 果

1.蔗糖密度梯度離心純化 HRSV:(1)感染性效價和蛋白含量:所收集組分的感染性效價為 2.50～3.75 lgCC ID50/m l,各組分間感染性效價差異不大。蛋白含量以 3號組分的 86.10m g/m l最高,從 8號組分開始逐漸趨平(圖 1)。(2)純化產(chǎn)物的鑒定:經(jīng) SDS -PAGE還原電泳,僅 7～11號 5個組分都在 60～70kDa間可見一主要的蛋白帶,與 HRSV F蛋白63kDa相對分子質(zhì)量接近(圖 2),W estern blot證實該條帶具有 HRSV特異性(圖 3)。上述 5個組分中,以7號和 8號組分的目的蛋白病毒含量較高,這與圖 1所顯示的病毒效價有一個小峰相吻合。

2.Sepherose 4FF凝膠過濾層析純化 HRSV: (1)HRSV Sepherose 4FF凝膠過濾層析圖:HRSV經(jīng)過 Sepherose 4FF凝膠過濾層析呈現(xiàn) 2個峰。在約15m in時出現(xiàn)第 1峰 (小峰);在約 30m in時出現(xiàn)第 2峰(大峰)。第 2峰為目的病毒峰 (圖 4)。(2)感染性效價及蛋白含量:凝膠過濾層析收集樣品中,4～8號樣品(第 2峰)均含有病毒,以 5號樣品的感染性效價最高,為 4.50 lgCC ID50/m l;蛋白含量也以 5號樣品的 4.65m g/m l最高,6、7號組分次之 (圖 5)。(3)純化產(chǎn)物的鑒定:4～8號樣品 (第 2峰)都在 60～70kDa間可見一主要的條帶,并且條帶的粗細(xì)與蛋白含量檢測結(jié)果一致(圖 6)。 3.免疫原性:選取蔗糖密度梯度離心所得混合樣及 Sepharose 4FF凝膠過濾層析所得蛋白含量最高的

圖 6 Sepharose 4FF凝膠過濾層析純化樣品的電泳圖

5號樣品進(jìn)行免疫原性評價(表 1)。(1)純化方式對免疫效果的影響:蔗/甲醛/A l-/1組和層/甲醛/A l

-/1組的中和抗體 GM T和抗體陽性率均相同,分別為1∶4.00和 40%;蔗/甲醛/A l+/1組和層/甲醛/A l

+/1組的抗體陽性率相同,均為 60%,而中和抗體

GM T凝膠過濾層析法純化樣是蔗糖密度梯度離心純化樣的 1.3倍,但差異無顯著的統(tǒng)計學(xué)意義 (P= 0.423)。(2)鋁佐劑對免疫效果的影響:含鋁佐劑組的抗體陽性率和中和抗體 GM T都比不含鋁組高,尤以含鋁佐劑 2針免疫組最高,但與其他組相比,差異

均無統(tǒng)計學(xué)意義 (P=0.444～1.000和 P=0.423～

0.815)。(3)免疫針數(shù)對免疫效果的影響:含鋁和不含鋁 2針免疫組的抗體陽性率是 1針免疫組的 1.7

倍和 2.5倍,差異均無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.444和P=1.000);中和抗體 GM T分別是 1針免疫組的 3.5倍和 2.5倍,差異均無顯著的統(tǒng)計學(xué)意義 (P=0.075和 P=0.374)。(4)病毒滅活試劑對免疫效果的影響:層/甲/A l-/1組和層/BPL/A l-/1組的抗體陽性率和中和抗體 GM T均相同。層/BPL/A l+/1組的抗體陽性率和中和抗體 GM T均比層/甲醛/A l+/1組高(P>0.05)。

表 1 小鼠免疫后中和抗體水平

討 論

本文對蔗糖密度梯度離心和 Sepherose 4FF凝膠過濾層析 2種方法純化 HRSV的效果和效率作了比較,結(jié)果表明上述 2種方法均能成功獲得目的病毒。

實驗中,HRSV經(jīng) 30倍濃縮,濃縮前后感染性效價相差不大(理論上應(yīng)增加約 1.5 lgCC ID50/m l),分析認(rèn)為與 HRSV在常溫條件下極不穩(wěn)定有關(guān)。在 22℃條件下,HRSV的感染性效價每天下降 0.2～1.0 lgCC ID50/m l[2]。HRSV經(jīng)蔗糖密度梯度離心,各收集組分的感染性效價差異不大。主要原因是組分中含有高度黏稠的蔗糖,其高滲能力會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性,同時也會導(dǎo)致極不穩(wěn)定的 HRSV喪失感染力。經(jīng)SDS-PAGE還原電泳,有 5個組分都在 60～70kDa間可見一主要條帶,經(jīng)檢測證實為 HRSV F蛋白,同時含有少量的BSA。上述條帶與W estern b lo t顯示的40～62kDa間的條帶大小不一致。其原因可能是:①W estern b lo t上樣量增加后,造成 60～70kDa間的條帶下移至 50kDa左右。蔗糖密度梯度離心收集的8號樣品在 SDS-PAGE還原電泳時上樣量 5μl,與圖3中 2泳道相比,上樣量增加后,60～70kDa間的條帶下移至 50kDa左右,且與W estern b lot(圖 4)5μl上樣量呈現(xiàn)出的條帶大小相近、形狀相似。所以上樣量增加造成條帶下移的可能性較大;②HRSV F蛋白在β-巰基乙醇的作用下產(chǎn)生 47～52kDa的 F1亞基,我們使用的一抗能與 F蛋白的 F1a表位特異性結(jié)合[7～9]。從蛋白含量曲線上可以看出,這 5個組分的蛋白含量遠(yuǎn)低于 2～6號組分,后者主要是一些雜蛋白。HRSV經(jīng) Sepherose 4FF凝膠過濾層析呈現(xiàn) 2個峰。第 1峰無目的產(chǎn)物;第 2峰的 3個樣品均含有目的病毒,SDS-PAGE還原電泳顯示在 60～70kDa間可見一主要的條帶,但W estern blot不能證實該條帶具有 HRSV特異性。分析可能是在凝膠過濾層析時, 1m l上樣量過低 (僅為蔗糖密度梯度離心上樣體積的1/500),經(jīng)柱層析純化后,病毒又被稀釋,未經(jīng)濃縮的樣品病毒含量低,導(dǎo)致W estern blot無法鑒別。將 2種方法制備的純化樣品免疫 ICR小鼠,抗體陽轉(zhuǎn)率相同,中和抗體 GM T凝膠過濾層析法純化樣是蔗糖密度梯度離心純化樣的 1.7倍。加鋁佐劑有助于提高抗體陽轉(zhuǎn)率,加鋁 2針免疫組的中和抗體 GM T最高。所以使用 HRSV免疫小鼠時,加鋁佐劑、2針免疫十分必要。各免疫組間均無顯著的統(tǒng)計學(xué)差異,主要與樣本數(shù)較少有關(guān)。

蔗糖密度梯度離心法和凝膠過濾層析法是目前常用于疫苗生產(chǎn)的病毒純化方法。對于極不穩(wěn)定的HRSV,蔗糖密度梯度離心法操作較為繁瑣,且比較費時,加上在蔗糖介質(zhì)中離心會對病毒顆粒造成損傷,易導(dǎo)致病毒喪失感染性[11]。另外,由于蔗糖的高度黏稠和高滲透性會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性,所以在對樣品進(jìn)行感染性效價分析前必須將其除去。凝膠過濾層析法設(shè)備簡單,操作方便,實驗周期短,有利于保持HRSV的穩(wěn)定,并且僅用蔗糖密度梯度離心 1/500的上樣體積就能達(dá)到與之同樣的免疫效果。綜上所述,我們認(rèn)為選用凝膠過濾層析法純化 HRSV比蔗糖密度梯度離心法更好。后續(xù)試驗中還需對凝膠過濾層析條件進(jìn)行優(yōu)化,使用無血清培養(yǎng)基增殖病毒、增加病毒濃縮倍數(shù)以及對純化所得病毒樣品進(jìn)行濃縮是十分必要的。

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