許巧情，黃 翠(長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北荊州434025）

趙朝陽，周 鑫(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水魚類遺傳育種與養(yǎng)殖生物學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214081）

近年來，克氏原螯蝦(Procambarusclarkii）在全國各地人工養(yǎng)殖方興未艾。據(jù)統(tǒng)計(jì)，僅湖北省荊州地區(qū)養(yǎng)殖克氏原螯蝦的水面就已經(jīng)達(dá)到數(shù)萬公頃。但隨著人工養(yǎng)殖面積的迅速擴(kuò)大，病害的發(fā)生也越來越頻繁和嚴(yán)重。國內(nèi)已相繼報(bào)道了克氏原螯蝦的螺原體病、爛鰓病等疾病[1]，這些疾病已經(jīng)給克氏原螯蝦養(yǎng)殖者帶來了重大經(jīng)濟(jì)損失[2，3]。傳統(tǒng)上治療和預(yù)防克氏原螯蝦疾病主要依賴抗生素、化學(xué)藥物等，但這些藥物濫用造成的環(huán)境污染、藥物殘留、病菌的耐藥性等問題已嚴(yán)重困擾克氏原螯蝦的養(yǎng)殖，而提高機(jī)體免疫力是進(jìn)行疾病防治的基礎(chǔ)，因此加強(qiáng)對(duì)克氏原螯蝦免疫機(jī)能的研究尤為重要。

甲殼動(dòng)物機(jī)體的免疫防御功能主要依賴于血細(xì)胞的吞噬、包掩等細(xì)胞免疫反應(yīng)，其體液中不具有免疫球蛋白，缺乏抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，體液免疫主要是指血淋巴中的一些酶和調(diào)節(jié)因子，如酚氧化酶原激活系統(tǒng)、溶血素、凝集素、溶菌酶、蛋白酶抑制劑等。凝集素是一種能使細(xì)菌、脊椎動(dòng)物的紅細(xì)胞、某些寄生蟲等發(fā)生凝集的因子，它實(shí)際上是一個(gè)蛋白質(zhì)家族，具有結(jié)構(gòu)異質(zhì)性和異物結(jié)合位點(diǎn)的特異性，對(duì)熱不穩(wěn)定(56℃15min即可失活），其活性需Ca2＋激活。它的作用類似于脊椎動(dòng)物的抗體，是甲殼動(dòng)物體內(nèi)的一種免疫識(shí)別因子[4-6]。中草藥具有補(bǔ)充營養(yǎng)，提高機(jī)體的特異性和非特異性免疫力的功能；具有抗菌、抑制病毒等方面的作用[7]。目前，關(guān)于中草藥對(duì)甲殼動(dòng)物凝集素的影響報(bào)道較少，而有關(guān)中草藥對(duì)克氏原螯蝦凝集素影響的研究尚未見報(bào)道。因此，通過對(duì)克氏原螯蝦血清溶血素、凝集活性的測定及進(jìn)一步研究，篩選促進(jìn)生長和調(diào)節(jié)克氏原螯蝦非特異性免疫功能的中草藥免疫調(diào)節(jié)劑，可進(jìn)一步為克氏原螯蝦免疫應(yīng)答機(jī)理研究和提高其抗病能力提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

克氏原螯蝦購于湖北省荊州市鐘鼓樓市場；陳皮、甘草、淫羊藿3種中草藥購于湖北省荊州市同濟(jì)大藥房；蝦飼料由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心提供；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus）、溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus）、大腸桿菌(Escherichiacoli）、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila）均由長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。陳皮、淫羊藿和甘草的有效成分采用醇提法提取后[8]，分別添加到飼料中。

1．2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)選用同批次、健康、規(guī)格相近的克氏原螯蝦700多只，隨機(jī)分為4組，其中對(duì)照組只投喂蝦飼料原料，其余3組為試驗(yàn)組，分別投喂添加了陳皮、淫羊藿、甘草的蝦飼料。每組設(shè)置9個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)的水箱中放養(yǎng)20只克氏原螯蝦。試驗(yàn)期間，所有試驗(yàn)蝦分別養(yǎng)于36只完全相同的室內(nèi)水箱中，室內(nèi)溫度20～26℃，管理?xiàng)l件一致。以制備的3種中草藥添加劑飼料和飼料原料進(jìn)行投喂，每天定時(shí)、定點(diǎn)、定量投喂。整個(gè)飼養(yǎng)過程中，按克氏原螯蝦常規(guī)飼養(yǎng)管理進(jìn)行。在投喂后第7、14、21、28天分別取樣測定血清中的溶血素含量和凝集活性。

1．3 血清的制備

將克氏原螯蝦的頭胸甲打開，撥開2片鰓葉，把覆蓋在心臟上方的薄膜輕輕跳開，露出心臟，再從心臟部位抽取血淋巴，于室溫靜置2～3h，以移液槍采取血清。

1．4 雞紅細(xì)胞懸液的制備

先采集新鮮雞血，用Alsever's液保存，3000r／min離心15min后，再加0．85%滅菌生理鹽水洗滌2次以除去Alsever's液，最后用0．85%滅菌生理鹽水分別配成體積分?jǐn)?shù)為3%和5%的雞紅細(xì)胞懸液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．5 克氏原螯蝦血清溶血活性的測定

參照文獻(xiàn) [4]的方法測定。取2．5ml體積分?jǐn)?shù)為3%的雞紅細(xì)胞懸液與0．1ml蝦血清混合均勻，每個(gè)樣品重復(fù)3次，25℃保溫1h。在對(duì)照管中加入2．5ml體積分?jǐn)?shù)為3%的雞紅細(xì)胞懸液和0．1ml 0．85%滅菌生理鹽水，與試驗(yàn)管同時(shí)保溫，取出后立即冰浴以終止反應(yīng)，經(jīng)1500r／min離心15min后獲得上清液。以對(duì)照管上清液作空白，于752型分光光度計(jì)540nm處測光密度。

1．6 克氏原螯蝦血清凝集紅細(xì)胞活性的測定

測定方法采用分光光度法[9]。將克氏原蝦血清按照倍比稀釋方法進(jìn)行稀釋，取體積分?jǐn)?shù)為5%的雞紅細(xì)胞2．5ml分別加入稀釋后的血清中。置于25℃保溫40min后，測定波長600nm處的光密度。最終血清效價(jià)為能與雞紅細(xì)胞發(fā)生明顯凝集反應(yīng)的最高稀釋度的倒數(shù)，即測得吸光度越低，則凝集活性越明顯。

1．7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 15．0軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2．1 3種中草藥對(duì)克氏原螯蝦血清溶血活性的影響

由表1可知，投喂28d后，淫羊藿組的克氏原螯蝦血清溶血活性平均值為0．806，且與對(duì)照組之間差異極顯著(P＜0．01）；而甘草組的克氏原螯蝦血清溶血活性平均值為0．527，與對(duì)照組之間差異顯著（P＜0．05）；陳皮組的克氏原螯蝦血清溶血活性平均值為0．372，與對(duì)照組之間沒有明顯的差異(P＞0．05）。

表1 投喂不同時(shí)間后各組克氏原螯蝦血清的溶血活性

2．2 3種中草藥對(duì)克氏原螯蝦血清凝集紅細(xì)胞活性的凝集效價(jià)的影響

由表2可知，投喂28d后，淫羊藿組和甘草組的凝集效價(jià)明顯高于對(duì)照組，飼喂7d后的甘草組和淫羊藿組，其凝集效價(jià)分別達(dá)到13．33和10．67，明顯高于對(duì)照組，在隨后的第14、21、28天的3次取樣中淫羊藿組和甘草組凝集活性不斷上升，淫羊藿組在第28d時(shí)達(dá)到26．67，甘草組達(dá)到53．33。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，淫羊藿組和甘草組均有顯著的提高(P＜0．05），而陳皮組差異不顯著(P＞0．05）。

表2 投喂不同時(shí)間后各組克氏原螯蝦血清凝集紅細(xì)胞活性的凝集效價(jià)

3 討論與小結(jié)

溶血素是無脊椎動(dòng)物免疫防御系統(tǒng)中的一種重要的非特異性免疫因子，其作用類似于脊椎動(dòng)物的補(bǔ)體系統(tǒng)，可以溶解異物細(xì)胞，參與調(diào)理作用。無脊椎動(dòng)物的溶血素與脊椎動(dòng)物血細(xì)胞表面的特異性糖鏈結(jié)合后，破裂細(xì)胞膜造成溶血現(xiàn)象。溶血素活性的高低反應(yīng)了機(jī)體識(shí)別和排除異種細(xì)胞能力的大小。研究表明：加州美對(duì)蝦(Farfantepenaeuscaliforniensis）、日本對(duì)蝦(Marsupenaeusjaponicus）和中國對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis）血淋巴中存在溶血素表現(xiàn)出對(duì)雞紅細(xì)胞、人B型血細(xì)胞和鼠紅細(xì)胞的溶血活性。溶血活性大小與對(duì)蝦的體質(zhì)有密切關(guān)系，可以用作評(píng)價(jià)對(duì)蝦健康狀況的指標(biāo)[10]。日本對(duì)蝦血淋巴液對(duì)雞紅細(xì)胞具有一定的溶血作用，而瀕死對(duì)蝦的溶血活性大大降低[11]，這說明溶血素與對(duì)蝦的體質(zhì)有密切關(guān)系。本試驗(yàn)結(jié)果表明，連續(xù)投喂中草藥，可引起克氏原螯蝦血清中溶血活性增加，從而提高其免疫能力，這與對(duì)日本對(duì)蝦的研究一致，日本對(duì)蝦經(jīng)注射蟲草多糖刺激后，溶血素活性大大增強(qiáng)，24h時(shí)溶血活性即比對(duì)照組高出48%，至72h時(shí)溶血活性達(dá)到最高[11]。

凝集素在無脊椎動(dòng)物血液中的重要作用是起選擇凝集作用，是免疫防御的重要體液因子之一，涉及一些水生動(dòng)物的幼體附著和變態(tài)行為。如多毛類動(dòng)物石灰蟲(Calcarinasp．）體內(nèi)產(chǎn)生的凝集素能識(shí)別海生假單胞菌外聚物中的葡萄糖，并與之結(jié)合，誘導(dǎo)石灰蟲幼體附著和變態(tài)行為[12]。到目前為止，許多甲殼動(dòng)物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)有凝集素的存在[4]，它們對(duì)多種脊椎動(dòng)物的紅細(xì)胞均有凝集作用。其中家兔紅細(xì)胞對(duì)甲殼動(dòng)物的凝集素最為敏感，斑紋蟳(Charybdiscruciata）、紅星梭子蟹(Portunussanguinolentus）、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus）、華溪蟹(Sinopotamonyangtsekiense）、鋸緣青蟹（Scyllaserrata）與兔紅細(xì)胞凝集活性最強(qiáng)，血清凝集活力均為211[5]；南美白對(duì)蝦(Penaeusvannamei）對(duì)家兔紅細(xì)胞的凝集作用最強(qiáng)，凝集效價(jià)為212，其次為家鴿，為25，家雞22，對(duì)鵪鶉紅細(xì)胞的凝集活力僅為20，而對(duì)人的A、B、O血型及山羊(Caprahircus）、家鴨(Anasdomestica）、水蛇（Enhydrischinensis）、牛蛙(Ranacatesbeiana）、鯽魚(Carassiusauratus）8 種紅細(xì)胞無凝集作用[13]。

凝集素具有可誘導(dǎo)性，給水產(chǎn)無脊椎動(dòng)物注入抗原或當(dāng)無脊椎動(dòng)物受到損傷時(shí)，其體內(nèi)凝集素活性發(fā)生明顯改變。例如給日本對(duì)蝦注射細(xì)菌后，其血淋巴凝集活力發(fā)生明顯變化[12]。用弧菌誘導(dǎo)過的中國對(duì)蝦，凝集素凝集活力明顯增強(qiáng)，而在己發(fā)病的病蝦體中的凝集素活力下降[14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，以3種中草藥連續(xù)投喂克氏原螯蝦1個(gè)月后其凝集活性明顯提高，這說明中草藥能提高克氏原螯蝦非特異性免疫能力。無獨(dú)有偶，采用添加0．5%和1．0%的復(fù)方中草藥投喂河蟹(Eriocheirsinensis），其血清的凝集效價(jià)均得到了顯著的提高[15]。

凝集素存在的部位在不同的生物中存在差異。早在1982年，Vasta[16]曾在美洲巨蠣(Crassostrea virginica）的血清中發(fā)現(xiàn)有2種血細(xì)胞凝集素：一種游離存在于牡蠣的血清中，另一種可以牢固地吸附在牡蠣血細(xì)胞的細(xì)胞膜上，這種細(xì)胞膜結(jié)合型的血細(xì)胞凝集素能夠凝集馬、貓、小鼠等多種動(dòng)物的血細(xì)胞，推斷這種細(xì)胞膜結(jié)合型的凝集素可能會(huì)在異物識(shí)別中提供受體位點(diǎn)，以促進(jìn)牡蠣血細(xì)胞同外源異物間的結(jié)合，從而有利于異物的排除，增強(qiáng)了免疫功能。但在中國對(duì)蝦血細(xì)胞的細(xì)胞膜上沒有發(fā)現(xiàn)凝集因子的存在，說明中國對(duì)蝦的血細(xì)胞凝集素可能僅僅游離并存在于血淋巴液中，而未與血細(xì)胞發(fā)生吸附[17]。

凝集素活性的測定方法常見的有2種，一種是通過凝集素與新鮮的或經(jīng)甲醛、戊二醛固定的動(dòng)物紅細(xì)胞凝集反應(yīng)的效價(jià)來測定，另一種是用分光光度法測定[12]。第一種方法是利用 “雙倍系列稀釋法”通過肉眼觀察試驗(yàn)結(jié)果，因而測量誤差較大。而且有時(shí)會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)失敗，例如牟海津等[17]采用 “雙倍系列稀釋法”研究中國對(duì)蝦血細(xì)胞膜制品對(duì)雞、小鼠、兔等動(dòng)物的血紅細(xì)胞進(jìn)行凝集試驗(yàn)時(shí)，均未發(fā)現(xiàn)有凝集現(xiàn)象的發(fā)生。而分光光度法是利用凝集素與紅細(xì)胞相互作用后，凝集的紅細(xì)胞下降快的原理，測定上清的光密度值[9]。本試驗(yàn)也據(jù)此原理測定克氏原螯蝦血清凝集紅細(xì)胞活性，得到了較好的結(jié)果，也證明分光光度法效果相對(duì)較好。

陳皮、甘草、淫羊藿3種中草藥能夠誘導(dǎo)克氏原螯蝦溶血素和凝集素的產(chǎn)生，提高溶血素和凝集素在血淋巴液中的濃度，從而增強(qiáng)克氏原螯蝦的免疫功能。因此，在克氏原螯蝦養(yǎng)殖中，使用陳皮、甘草、淫羊藿等免疫增強(qiáng)藥物，有望對(duì)增強(qiáng)克氏原螯蝦的體質(zhì)、減少病害的發(fā)生起到一定的作用。

[1]Wang W，Gu W，Ding Z F．A novel Spiroplasma pathogen causing systemic infection in the crayfishProcambarusclarkii(Crustacea：Decapod）in China [J]．FEMS Microbiology Letters，2005，249：131-137．

[2]陳昌福，賀中華，孟小亮 ．湖北省克氏原螯蝦養(yǎng)殖現(xiàn)狀與產(chǎn)業(yè)發(fā)展中的技術(shù)問題 [J]．養(yǎng)殖與飼料，2008，3（11）：14-19．

[3]陳昌福，劉遠(yuǎn)高，何廣文，等 ．克氏原螯蝦暴發(fā)病細(xì)菌性病原的研究 [J]．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，28（2）：193-197．

[4]曹劍香，簡紀(jì)常，吳灶和，等 ．凡納濱對(duì)蝦血清凝集素、溶血素的特性研究 [J]．海洋科學(xué)，2006，30（6）：1-5．

[5]戴聰杰，陳寅山 ．南美白對(duì)蝦血清凝集素的凝集活性及部分性質(zhì)研究 [J]．水產(chǎn)科學(xué)，2005，24（1）：13-16．

[6]徐海圣 ．中華絨螯蟹常見病原的分離鑒定、致病及免疫機(jī)制研究 [D]．杭州：浙江大學(xué)，2004．

[7]錢 昆，周 濤 ．植物香辛料復(fù)配抑菌效果的研究 [J]．食品與機(jī)械，2007，23（2）：93-95．

[8]張國斌 ．胭脂魚幼魚適宜蛋白能量水平及中草藥對(duì)其非特異性免疫機(jī)能的影響 [D]．武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009．

[9]王者鵬，荊云鵬，金 瑾 ．分光光度計(jì)法測定凝集素對(duì)紅細(xì)胞的凝集活性 [J]．濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1990，13（1）：14-16．

[10]朱俊興，王 雷 ．中國對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinesis）溶血素對(duì)人血紅細(xì)胞膜損傷的電鏡觀察及幾種糖類對(duì)其活性的影響 [J]．海洋與湖沼，2003，34（Special issue）：43-48．

[11]牟海津，江曉路，劉樹青 ．日本對(duì)蝦溶血素的活性測定及性能研究 [J]．海洋與湖沼，1999，30（4）：362-367．

[12]王長法，張士璀，王昌留 ．水生無脊椎動(dòng)物凝集素研究概述 [J]．海洋科學(xué)，2005，29（4）：63-67．

[13]梁青龍，戴聰杰，陳寅山 ．南美白對(duì)蝦血清凝集素的凝集活性及部分性質(zhì)研究 [J]．水產(chǎn)科學(xué)，2005，24（1）：13-16．

[14]王克夷，許 強(qiáng) ．凝集素和毒素 [J]．生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，2000，32（3）：201-205．

[15]崔青曼，張耀紅 ．復(fù)方添加劑對(duì)河蟹成活率及抗感染能力的影響 [J]．水利漁業(yè)，2001，21（4）：40-41．

[16]Vasta G R．A cell membrane-associated lectin of the oyster hemocyte [J]．J Inver pathol，1982，40：367-377．

[17]牟海津，江曉路，劉樹青 ．中國對(duì)蝦血細(xì)胞凝集素的性能研究 [J]．中國水產(chǎn)科學(xué)，1999，6（3）：32-35．