鄒 磊，甄少波，宋 楊

(1.中國環(huán)境管理干部學(xué)院，河北秦皇島066004;2.中國勞動關(guān)系學(xué)院，北京100037)

食品抗熱門貨能力檢測方法的研究進展

鄒 磊1，甄少波2，宋 楊1

(1.中國環(huán)境管理干部學(xué)院，河北秦皇島066004;2.中國勞動關(guān)系學(xué)院，北京100037)

論述了食品抗氧化能力體內(nèi)和體外檢測的方法。重點介紹了二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)法、ABTS法、硫代巴比妥酸(TBARS)法、Fe3+還原能力(FRAP)法、氧自由基清除能力測定法(ORAC)的機理以及在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用，探討了食品抗氧化檢測方法的相關(guān)性和標(biāo)準(zhǔn)化問題，為選擇合適的抗氧化方法提供參考。

抗氧化，檢測方法，ORAC

癌癥與冠心病是世界公認(rèn)的人類健康殺手。在西方國家，癌癥是導(dǎo)致65歲以下人員死亡的最主要原因［1］，每年美國政府花在治療心血管疾病上的資金高達500～1000億美元［2］。大量的證據(jù)表明細(xì)胞代謝或脂類過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的自由基是癌癥和冠心病形成的病因［3－4］。抗氧化物質(zhì)可以阻斷自由基侵襲，降低了癌癥、冠心病及其他老年疾病的發(fā)病風(fēng)險。食物中抗氧化物質(zhì)長期以來倍受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注，從食物中獲取抗氧化物質(zhì)成為一種健康有效的生活方式，科研人員也相繼從食品中發(fā)現(xiàn)大量抗氧化物質(zhì)。食物中抗氧化物質(zhì)能夠保護食物免受氧化損傷而變質(zhì)，在人體消化道內(nèi)具有抗氧化作用，防止消化道發(fā)生氧化損傷，吸收后可在機體其他組織器官內(nèi)發(fā)揮作用，來源于食物的某些具有抗氧化作用的提取物可以作為治療藥品。如何正確真實地評價食品的抗氧化性成為首要解決的問題，食品抗氧化能力的評價方法隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和設(shè)備的更新而不斷地發(fā)展和改變。一些過程繁瑣、準(zhǔn)確性不高的評價方法逐漸被淘汰，下面重點介紹一些近年來出現(xiàn)的食品抗氧化能力評價方法。

1 體外抗氧化能力評價方法

1.1 二苯代苦味?；杂苫?DPPH·)

195 8年，Blois首次將DPPH·法應(yīng)用于抗氧化

劑的篩選研究，近年來該方法在抗氧化劑研究中受到普遍重視，它克服了傳統(tǒng)方法的一些缺陷，具有快速、簡便、靈敏、易檢測和直接可行的優(yōu)點，被廣泛用于抗氧化劑的研究［5］。該方法通過測定實驗樣品對DPPH·的清除能力來反映其抗氧化能力，DPPH·在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，其結(jié)構(gòu)中含有3個苯環(huán)，1個氮原子上有1個孤對電子，其甲醇溶液呈深紫色，在517nm有強吸收。有自由基清除劑存在時，DPPH·的單電子被配對而使其顏色變淺，在最大吸收波長處的吸光度變小，而且這種顏色變淺的程度與配對電子數(shù)成化學(xué)劑量關(guān)系，從而用于評價實驗樣品的抗氧化能力［6］。Manuel Sandoval等使用DPPH·法評價了十字花科植物瑪卡(秘魯?shù)囊环N蔬菜，類似中國的長纓蘿卜)的抗氧化能力［7］，其清除DPPH自由基的IC50為0.61mg/mL。新加坡學(xué)者Leong LP對新加坡當(dāng)?shù)氐?7種蔬菜進行了抗氧化能力的測定［8］，表明奇異果(ciku)、薩拉卡(salak)、楊桃(star fruit)、草莓(strawberry)、李子(plum)等具有DPPH·清除能力。國內(nèi)鄒磊等人用清除DPPH·法評價豆豉提取物的抗氧化能力［9］;包斌等人用DPPH·法評價了羊脾臟提取液的抗氧化特性［10］，夏其樂等人做了楊梅汁清除自由基及抑制油脂氧化作用的研究［11］，楊梅汁提取物具備一定的DPPH·清除能力IC50為20.2mg/mL。

1.2 ABTS法(TEAC，Trolox equivalent antioxidant capacity assay)

ABTS法，又名TEAC法。1993年由Miller建立該方法，ABTS法測定總抗氧化能力的原理是，ABTS在適當(dāng)?shù)难趸瘎┳饔孟卵趸删G色的ABTS+自由基，在抗氧化物存在時ABTS+自由基的產(chǎn)生會被抑制，在734nm或405nm測定ABTS+自由基的吸光度即可測定并計算出樣品的總抗氧化能力［12］。實驗一般使用Trolox用作參考，結(jié)果表示為Trolox當(dāng)量濃度。該方法也是一種普遍使用的測定食品的抗氧化能力的方法。Liu等［13］使用TEAC法評價了荔枝花不同溶劑提取物的抗氧化性;Seeram等［14］評價了美國富含多酚飲料的抗氧化性;Du等人使用TEAC法評價了獼猴桃果實抗氧化性［15］。

1.3 硫代巴比妥酸法(TBARS)

TBARS法是測量脂肪酸，細(xì)胞膜和生物組織脂質(zhì)過氧化的最古老也是應(yīng)用最多的方法，它還是應(yīng)用于粗提生物體系最容易的方法［16］，氧化的油脂會生成丙二醛，一分子的丙二醛可同兩分子的硫代巴比妥酸(TBA)作用生成有色化合物，該有色化合物在吸光度530nm左右有吸收。因此，可通過測定丙二醛的量來評價油脂的氧化程度。當(dāng)油脂系統(tǒng)中存在抗氧化物質(zhì)時，丙二醛的產(chǎn)生就會受到抑制，通過檢測丙二醛的抑制程度來說明抗氧化物質(zhì)的抗氧化能力。Ignasius R A等人使用低密度脂蛋白作為氧化底物，利用TBARS法測定了Mallika和Cikuray品種黑豆種皮的抗氧化能力［17］，測定值分別為37.10、30.37nmol MDA/g低密度脂蛋白，參照物rutin的測定值為30.10nmol MDA/g。Barreira Joao CM等人利用TBARS法測定了栗子各個部分的抗氧化能力，實驗中使用豬腦組織作為氧化底物，結(jié)果表明栗子皮具有很高的抗氧化能力［18］。

1.4 Fe3+還原能力法(FRAP)

FRAP法原理為在較低pH環(huán)境下，F(xiàn)e3+－三吡啶三吖嗪(tripyridyl－triazine，TPTZ)可被樣品中還原物質(zhì)還原為二價鐵形式，呈現(xiàn)出藍色，并于吸光度593nm處具有最大光吸收，根據(jù)吸光度大小計算樣品抗氧化活性強弱［19］。Stangeland使用FRAP法測定了35種烏干達本土水果和蔬菜［20］，檢測值范圍從最高(72.3±13.5)mmol/100g鮮重(孜然芹種子，Syzygium cuminii seed)到最低(0.09±0.05)mmol/100g鮮重(筍瓜，Cucurbita maxima fruit)。郭長江等用FRAP對36種蔬菜、30種水果的抗氧化活性進行了測定比較，并且分析了其抗氧化活性與維生素C含量的關(guān)系［21］。

1.5 氧自由基清除能力測定法(ORAC，The oxygen radical absorbance capacity)

目前各國科研人員采用的ORAC方法多是引自Cao 的方法［22］。最早是使用 β－phycoerythrin(β－PE)作為熒光探針，后來改用更為合適的熒光素(Fluorescein，F(xiàn)L)作為熒光探針，反應(yīng)體系由 FL、AAPH(2，2′－azobis－2－methyl－propanimidamide)、磷酸鉀緩沖溶液及抗氧化物構(gòu)成，靜置一段時間后，用紫外、熒光及LC/MS方法同時檢測分析反應(yīng)混合物，記錄熒光值?？寡趸瘎┳饔孟碌臒晒馑ネ饲€下面積與熒光自然衰退曲線下面積的差作為衡量抗氧化劑的抗氧化能力指標(biāo)，將結(jié)果以抗氧化物質(zhì)Trolox作為標(biāo)準(zhǔn)進行表達。Elisia Ingrid等把ORAC法應(yīng)用于藍莓濃縮提取物的抗氧化研究，ORAC值直接和藍莓的花青素－3－葡萄糖苷的含量呈正相關(guān)［23］。Kriengsak Thaipon等使用 ORAC法、ABTS、DPPH、FRAP等方法全面檢測了番石榴提取物的抗氧化能力，研究結(jié)果表明，番石榴的抗氧化能力在水果中名列前茅［24］。

1.6 快速檢測方法

上述檢測方法在實驗室中進行，需要花費大量時間，檢測周期多為2～3h，無法滿足大量試樣的檢測。故國內(nèi)外開發(fā)出了一些抗氧化能力檢測試劑盒，方便快捷。試劑盒的原理是基于前述的反應(yīng)原理。例如碧云天牌總抗氧化能力檢測試劑盒(ABTS法)、碧云天牌總抗氧化能力檢測試劑盒(FRAP法)、Zenbio牌 ORAC Antioxidant Assay Kit等。

2 體內(nèi)抗氧化能力評價方法

體外抗氧化評價方法最大的缺陷就是無法真實模擬體內(nèi)環(huán)境，不能真實反映抗氧化物的實際抗氧化效果。體內(nèi)抗氧化研究一般都建立一定的動物疾病模型，因為許多疾病會導(dǎo)致體內(nèi)自由基產(chǎn)生過量，方便于檢測抗氧化物的功效。由于動物生命過程體內(nèi)就會產(chǎn)生自由基，也有不建立動物疾病模型，采用健康個體，采用進食前和進食后進行對比研究。用小鼠作為實驗對象，灌胃給予抗氧化物，檢測小鼠血漿、肝臟、腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH－PX)、丙二醛(MDA)含量變化。從上述三種酶和MDA的變化狀況來判定抗氧化的強度及效果。由于人體不可能直接對肝臟勻漿進行檢測，可以測定血液或者尿液中的MDA，以及血液中的SOD、CAT、GXH－PX來判定抗氧化的效果。王建華等研究了枸杞粗多糖在小鼠體內(nèi)的抗氧化作用［25］，用枸杞粗多糖生理鹽水溶液對D－半乳糖的衰老模型小鼠和正常小鼠灌胃。結(jié)果表明枸杞粗多糖能較顯著(p＜0.01)地提高小鼠血清、肝臟及腦組織中SOD活性，降低MDA含量。Dong Wang等人用豆豉提取物喂食小鼠(膽固醇喂食模型)［26］，結(jié)果顯示，實驗組小鼠肝臟和腎內(nèi)SOD活性、肝臟內(nèi)CAT活性和腎內(nèi)GSH－PX活性得到極顯著提高、MDA含量極顯著降低(p＜0.05)。Serafini等人研究了綠茶和黑茶對人類的體內(nèi)抗氧化能力［27］，10人分兩組，一組進食茶水，另一組為對照，結(jié)果顯示進食組的血漿抗氧化能力(TRAP)顯著高于對照組。

3 討論

3.1 不同抗氧化能力檢測方法的相關(guān)性

有些文獻報道指出不同方法檢測食品的抗氧化能力，結(jié)果顯示良好的相關(guān)性:Connor等發(fā)現(xiàn)測定藍莓抗氧化能力使用的ORAC法，F(xiàn)RAP法有很高的相關(guān)性［28］。Awika發(fā)現(xiàn)采用 ORAC 法，ABTS法和DPPH·法檢測高粱及其產(chǎn)品的抗氧化能力，方法有很高的相關(guān)性［29］。Kriengsak Thaipong在對番石榴的抗氧化研究中發(fā)現(xiàn)ABTS法，DPPH·法，F(xiàn)RA法和ORAC 法相關(guān)性很好［24］，相關(guān)系數(shù)在 0.68～0.97。然而食品成分非常復(fù)雜，各抗氧化物質(zhì)的抗氧化作用無法用單一的機制解釋。不少文獻報道也指出各個方法之間沒有太大的相關(guān)性，甚至用某法檢測某食品具有抗氧化能力，而使用另一方法檢測卻沒有抗氧化能力。李華等人利用數(shù)學(xué)統(tǒng)計方法對抗氧化檢測方法的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn):ABTS法和FRAP方法相關(guān)性最高，相關(guān)系數(shù)僅為0.6775。而金屬螯合檢測方法和其他方法相關(guān)性最差［30］。

另外由于測定樣品的不同，不同測定方法間的相關(guān)性明顯不一致，例如:Ou等人在測定不同蔬菜的抗氧化能力時，ORAC法和FRAP法的相關(guān)系數(shù)為0.0055、0.96、0.13、0.78、0.15、0.64、0.65、0.59、0.87、0.78、0.57 和0.43［31］。因此目前測定食品的抗氧化能力不能夠只用一種方法，應(yīng)該選用不同類型的方法。對于近十種方法，而且每種方法都各有利弊，選擇的確非常困難。

3.2 抗氧化能力檢測的標(biāo)準(zhǔn)化

抗氧化檢測方法各有利弊，但許多研究者認(rèn)為清除自由基的方法(DPPH·、ABTS、ORAC等)生物最相關(guān)，因此認(rèn)為這些方法是測定抗氧化能力的最佳方法。Prior等認(rèn)為ORAC是其中最好的一種方法［32］。ORAC法采用延長時間30min的反應(yīng)，抗氧化劑的保護性影響采用熒光衰減的面積表示，避免了選擇終點所帶來的誤差。此法測得的是總的抗氧化活性，而且可自動化，標(biāo)準(zhǔn)化。但該方法需要使用熒光光度計，自動化則需要熒光酶標(biāo)儀(普通實驗室沒有)，測定所需時間稍長。也有學(xué)者認(rèn)為使用FRAP方法是評價抗氧化能力的較為適宜的方法，原理明確，操作簡便，不需要特殊儀器，易于標(biāo)準(zhǔn)化［33］。鑒于食品抗氧化成分復(fù)雜，我國現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)中尚沒有出臺測定食品抗氧化能力的標(biāo)準(zhǔn)方法。簡便、快速、準(zhǔn)確的分析方法是歷來分析工作者所致力追求的目標(biāo)。如何建立食品抗氧化能力檢測標(biāo)準(zhǔn)方法，將是我們所面臨的巨大挑戰(zhàn)。

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Advances in detection methods of food antioxidant activity

ZOU Lei1，ZHEN Shao－bo2，SONG Yang1
(1.Environment Management College of China，Qinhuangdao 066004，China;2.China Institute of Industrial Relations，Beijing 100037，China)

In vitro and in vivo detection methods of food antioxidant activity were summarized.The mechanism and application of detection methods such as DPPH·，ABTS，TBARS，F(xiàn)RAP and ORAC were introduced.The correlations and standardization of detection methods were discussed.This research would provide a reference of choosing antioxidant activities detection method.

antioxidant activity;detection methods;ORAC

TS201.1

A

1002－0306(2011)06－0463－04

2010－05－19

鄒磊(1983－)，男，講師，研究方向:現(xiàn)代食品加工技術(shù)。