石 鶯，黃建軍，唐章文，譚亞麗，吉曉霞，凌 暉，蘇 琦

二烯丙基二硫 (diallyl disulfide，DADS)是大蒜中主要的脂溶性成分。DADS處理腫瘤細胞后，腫瘤細胞結(jié)構(gòu)及形態(tài)學表現(xiàn)有明顯的向正常細胞分化的趨勢［1］。進一步運用蛋白質(zhì)組學技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，DADS處理人胃癌MGC803細胞前后，有24種蛋白表達出現(xiàn)變化［2］，其中表達顯著上調(diào)的維甲酸相關(guān)孤核受體α(RORα)在DADS誘導(dǎo)MGC803細胞分化過程中的作用機制不明。RORα在調(diào)節(jié)體內(nèi)多種組織細胞的發(fā)育和(或)分化以及對抗疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［3］。有研究顯示，RORα具有抑制前列腺癌細胞［4］、結(jié)腸癌細胞［5］、乳腺癌細胞［6］增殖的作用，但是 RORα與胃癌的關(guān)系尚不清楚。故本研究通過觀察DADS對體外培養(yǎng)的人胃癌SGC7901(中分化腺癌)細胞與MGC803細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，觀察DADS處理前后人胃癌細胞中RORα蛋白表達的差異，探討DADS誘導(dǎo)人胃癌細胞分化的分子機制以及RORα與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 SGC7901、MGC803細胞由中南大學湘雅醫(yī)學院細胞中心引進。DADS為Fluka公司產(chǎn)品。核蛋白抽提試劑盒GK5112為上海捷瑞生物公司產(chǎn)品。BCA蛋白定量試劑盒為Pierce公司產(chǎn)品，RT－PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為Promega公司產(chǎn)品，總RNA提取試劑盒為美國Omega公司產(chǎn)品，均購于華美生物工程公司。兔抗人RORα多克隆抗體購自Santa Cruz公司，羊抗兔二抗購于武漢博士德生物公司。其他常規(guī)的化學用品、新生牛血清、RPMI－1640培養(yǎng)基均購自長沙瑞晶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 所有細胞用含體積分數(shù)為10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)于37°C，含體積分數(shù)為5%二氧化碳(CO2)的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞，按所需濃度接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板內(nèi)，待6～8 h細胞完全貼壁后，加用或換用含有藥物的培養(yǎng)液，培養(yǎng)至預(yù)定時間。本實驗中采用30 mg/L DADS濃度作為MGC803處理組的濃度。

1.2.2 形態(tài)學觀察 利用倒置顯微鏡對活細胞在接觸處理因素前后細胞形態(tài)學及生長狀況的變化進行動態(tài)觀察。制備細胞爬片，常規(guī)HE染色于鏡下觀察處理前后細胞形態(tài)學的改變。

1.2.3 免疫細胞化學染色 制備細胞爬片，預(yù)冷丙酮室溫固定10 min，自然風干，4°C冰箱保存。SP法常規(guī)檢測，滴加抗體前，切片經(jīng)高壓處理，修復(fù)暴露抗原。以PBS代替一抗作陰性對照，DAB顯色。

1.2.4 間接免疫熒光流式細胞術(shù) 常規(guī)消化收集細胞，1 000 r/min，離心5 min，計數(shù)制成1×109/L×1 ml的單細胞懸液。加4%多聚甲醛1 ml固定細胞，4°C冰箱保存?zhèn)溆?。用PBS洗滌離心2次，洗掉固定液，將細胞混勻，加細胞打孔劑0.1% ～0.2%Triton－X 100 1 ml，冰上孵育10 min，PBS洗滌離心2次，分裝成兩個體積基本相等的EP管;加50μl一抗(或PBS代替一抗作為陰性對照)，冰上孵育30～45 min;PBS洗滌離心2次，棄上清液;加50μl熒光標記的二抗 (FITC－二抗)冰上孵育30～45 min;PBS洗滌離心2次，棄上清液;用剩余的PBS重懸細胞，1%多聚甲醛0.5 ml細胞固定，上機檢測，流式細胞儀分析熒光強度。

1.2.5 半定量RT－PCR

1.2.5.1 引物合成 利用Primer Premier 5.0軟件進行引物設(shè)計，送交上海生物工程服務(wù)技術(shù)有限公司合成，引物序列如下所示:β－actin:上游引物:5'－TCTACAATGAGCTGCGTGTGG－3'，下游引物:5'－GGAACCGCTCATTGCCAATG－3'(496 bp);RORα:上游引物:5'－GTCAGCAGCTTCTACCTGGAC－3'，下游引物:5'－GTGTTGTTCTGAGAGTGAAAGGCACG －3'(482 bp)。

1.2.5.2 細胞總RNA提取 采用美國Omega公司總RNA提取試劑盒 (E.Z.N.A Total RNA Midi Kit，product#R6693)提取，按照試劑盒說明書步驟操作。1%的瓊脂糖凝膠電泳觀察，并用紫外分光光度計測定RNA的純度和濃度。

1.2.5.3 反轉(zhuǎn)錄 按照RT－PCR試劑盒說明書合成第一鏈cDNA。PCR體系中含有cDNA 2μl，2×Taq PCR Master Mix(0.1 U Taq DNA Polymerase/ml，500 mmol/L;dNTP each，50 mmol/L;pH 8.7的Tris－HCl;20 mmol/L KCl;4 mmol/L MgCl2)10 μl，上游引物 (10 pmol/μl)0.5 μl，下游引物(10 pmol/μl)0.5μl，加無核酸酶的水至終體積為20μl。優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性10 min;94°C變性30 s，60°C退火30 s，72°C延伸30 s，30個循環(huán);72°C最終延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取5μl產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用UV觀察EB染色條帶并照相。

1.2.6 Western blot檢測 用含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液培養(yǎng)人胃癌細胞，待細胞生長至對數(shù)生長期時，用30 mg/L DADS處理MGC803細胞8、12、24 h后收集細胞，根據(jù)核蛋白抽提試劑盒提取核蛋白;BAC法進行蛋白定量。10%分離膠，以每孔50μg的蛋白量加樣，進行SDS－PAGE電泳。將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)移條件為4°C，恒壓100 V，3 h。5%脫脂奶封閉4°C過夜。一抗 (1∶1 000)37℃孵育2 h，二抗37°C孵育1 h。于暗室中曝光，顯影、定影。膠片用薄層掃描儀進行灰度掃描，分析各產(chǎn)物的灰度值(V值)，將各V值與對應(yīng)標本的Vβ－actin相比，計算出樣本蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以 (x－±s)表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學觀察結(jié)果 MGC803細胞體積大，細胞質(zhì)相對少，細胞核大，染色深，核仁明顯，可見核分裂象;DADS處理24 h后，細胞大部分變成梭形或小圓形，細胞稀疏，核變小，染色變淡，核仁數(shù)量減少，核質(zhì)比減小。SGC7901細胞呈多邊形或不規(guī)則形，細胞致密，甚至堆積為復(fù)層，可見瘤巨細胞，核質(zhì)比例大，核大、深染，核仁多個，可見核分裂象，細胞大小不一，異型性明顯;DADS處理24 h后，細胞皺縮、變圓，體積變小，核仁少見，細胞質(zhì)比例增大，嗜酸性增強，核分裂象少見，細胞間隙明顯增大 (見圖1)。

2.2 免疫細胞化學檢測結(jié)果 RORα陽性染色主要位于細胞核，細胞質(zhì)中也可見少許陽性染色。以PBS代替一抗作為空白對照，DADS處理前RORα在兩種胃癌細胞中有弱陽性表達，DADS處理24 h后的SGC7901、MGC803細胞中呈強陽性表達 (見圖2)。

2.3 RT－PCR結(jié)果 灰度掃描定量分析結(jié)果顯示，DADS處理24 h后，SGC7901、MGC803細胞中RORα的表達量分別為(1.09±0.01)和 (0.97±0.01)，顯著高于對照組的 (0.45±0.03)和 (0.44±0.02)，差異有統(tǒng)計學意義 (t值分別為74.81和64.76，P＜0.01)。實驗重復(fù)3次。

2.4 Western blot分析 30 mg/L DADS處理人胃癌MGC803、SGC7901細胞8、12、24 h后，RORα蛋白表達量均較未處理組顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05，見表1、圖3)。實驗重復(fù)3次。

3 討論

前期工作表明:作為大蒜中主要的脂溶性成分，DADS不僅毒性低，抗腫瘤效果明顯，還是一種很有開發(fā)潛力的抗腫瘤藥物。用大蒜中主要的脂溶性抗腫瘤成分DADS處理腫瘤細胞后，腫瘤細胞結(jié)構(gòu)及形態(tài)學表現(xiàn)有明顯的向正常細胞分化的趨勢［1］;在鑒定DADS處理前后人胃癌MGC803細胞差異表達蛋白的蛋白組學研究過程中發(fā)現(xiàn)，DADS處理MGC803細胞后，一些有潛在誘導(dǎo)胃癌細胞分化作用的蛋白如RORα表達顯著上調(diào)［7］。一系列研究表明，RORα與體內(nèi)其他生物活性因子協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)細胞的生長、分化與凋亡［8－9］，對多種組織器官的發(fā)育起著關(guān)鍵作用。另外，RORα參與生物代謝的調(diào)控，在對抗心血管疾病、慢性炎癥、免疫功能不全、骨代謝障礙、腫瘤等一些病理過程中發(fā)揮重要作用。

本實驗利用多種方法觀察DADS處理人胃癌細胞前后RORα蛋白表達的變化。發(fā)現(xiàn) DADS處理人胃癌 MGC803、SGC7901細胞24 h后，與對照組相比，兩種腫瘤細胞均出現(xiàn)明顯的形態(tài)改變，提示DADS對人胃癌細胞有抑制增殖并誘導(dǎo)細胞向良性或正常細胞方向發(fā)展的作用。免疫細胞化學結(jié)果顯示，與對照組細胞核內(nèi)RORα蛋白弱陽性表達相比，DADS處理組細胞核內(nèi)棕黃色顆粒顯著增多，RORα蛋白強陽性表達。RT－PCR反映了 DADS對人胃癌 MGC803、SGC7901細胞RORα核酸水平表達的影響，其結(jié)果說明DADS誘導(dǎo)人胃癌細胞RORα編碼基因的表達上調(diào)。Western blot結(jié)果顯示，DADS處理人胃癌MGC803細胞8、12、24 h后，RORα蛋白相對表達量較對照組明顯上調(diào)。

圖1 光學顯微鏡下DADS處理前后人胃癌細胞的形態(tài) (HE染色，×400)Figure 1 Phase－contrastmicrographs of MGC803 and SGC7901 cells treated with 30 mg/L DADS

圖2 DADS處理前后人胃癌細胞中RORα的表達 (SP法，×400)Figure 2 Expression of RORαin MGC803 and SGC7901 cells treated with 30 mg/L DADS

表1 DADS作用不同時間對MGC803、SGC7901細胞中RORα蛋白表達的影響 (x－±s，n=3)Table 1 Expression of RORα in MGC803 and SGC7901 cells treated with 30 mg/L DADS for 8 h，12 h and 24 h

圖3 DADS處理前后RORα蛋白表達變化Figure 3 Expression of RORαin MGC803 and SGC7901 cells treated with 30 mg/L DADS

綜上所述，DADS能誘導(dǎo)人胃癌MGC803、SGC7901細胞RORα蛋白表達上調(diào)，RORα可能是DADS作用的潛在靶點，但RORα在DADS抑制人胃癌細胞增殖作用中的具體作用機制還有待于進一步研究。

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