鐘少林，王華榮，史 娟，2，3

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué)草業(yè)科學(xué)研究所，寧夏 銀川 750021;3.西北退化生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021)

苜蓿褐斑病是世界苜蓿(Medicagosativa)生產(chǎn)中危害最嚴(yán)重的病害之一，也是中國(guó)苜蓿生產(chǎn)中的主要病害。寧夏平均每年因該病害造成的產(chǎn)量損失為40%～60%[1]。苜蓿褐斑病病原菌可以危害所有的栽培苜蓿，還可侵染白花草木樨(Melilotusalbua)、紅豆草(Onobrychisviciaefolia)、藍(lán)胡盧巴(Trigonellacoerulea)、山野豌豆(Viciaamoena)以及紅三葉草(Trifoliumrepens)等豆科牧草植物，大田侵染后常造成苜蓿植株1/3～2/3葉片枯死脫落[2]，降低干草和種子的品質(zhì)，而且感染褐斑病的苜蓿因香豆雌酚等類黃酮物質(zhì)的大量增加，引起采食家畜流產(chǎn)、不育等疾病[3]。袁慶華等[4]對(duì)來(lái)自北京、新疆、內(nèi)蒙古、甘肅、山西等苜蓿假盤(pán)菌菌株進(jìn)行了培養(yǎng)性狀的研究，發(fā)現(xiàn)不同地理來(lái)源的苜蓿假盤(pán)菌菌株培養(yǎng)性狀存在顯著差異，且存在致病性分化現(xiàn)象，但有關(guān)苜蓿假盤(pán)菌寧夏菌株生物學(xué)特性的報(bào)道甚少[5-6]，因此研究寧夏菌株生物學(xué)特性對(duì)于了解不同生態(tài)區(qū)域條件下病原菌的生長(zhǎng)繁殖規(guī)律以及對(duì)指導(dǎo)苜蓿病害田間的綜合治理具有重要意義[7-8]。

1 材料與方法

1.1材料 供試菌種為苜蓿假盤(pán)菌(Pseudopezizamedicaginis)，由寧夏大學(xué)草業(yè)科學(xué)研究所提供，于2005年9月采用子囊孢子單孢分離法和常規(guī)組織塊分離法分離，從寧夏固原原州區(qū)種植的阿爾岡金苜蓿病葉上分離得到，用20%V8汁碳酸鈣瓊脂培養(yǎng)基[V8汁液200 mL(V8汁為美國(guó)進(jìn)口)、碳酸鈣 2 g、瓊脂17 g、蒸餾水800 mL。培養(yǎng)基配制好后用1 mol/L鹽酸和1 mol/L氫氧化鈉調(diào)pH值為6.0]培養(yǎng)。

1.2孢子懸浮液的制備 選取生長(zhǎng)30 d左右成熟好的菌落，置于滅菌的小燒杯中，加入滅菌水2 mL，用滅菌的鑷子充分將菌落搗碎，顯微鏡下觀察有大量子囊和子囊孢子的即為子囊孢子懸浮液(孢子濃度為3.0×105～1.5×106個(gè)/mL)。

1.3溫度對(duì)苜蓿假盤(pán)菌生長(zhǎng)的影響 選用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為20%V8汁碳酸鈣瓊脂培養(yǎng)基。分別吸取15 mL的孢子懸浮液，接種于培養(yǎng)基上，分別置于5、10、15、20、25、30、35和40 ℃黑暗培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)并測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.4水分對(duì)苜蓿假盤(pán)菌子囊孢子釋放和萌發(fā)的影響 將培養(yǎng)基上成熟的菌落分別移入皿蓋上有游離水和無(wú)游離水的培養(yǎng)基上，每皿移入5個(gè)菌落，均勻放置，10 d后肉眼觀察菌落釋放孢子情況。

葉片表面游離水保持0、2、4、6、8、10 h共6個(gè)梯度，利用離體葉，采用逆向產(chǎn)孢培養(yǎng)法，對(duì)接種后12 h的葉片進(jìn)行透明和染色，光學(xué)顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況，每個(gè)處理觀察50個(gè)孢子，計(jì)算孢子萌發(fā)率。

1.5pH值對(duì)苜蓿假盤(pán)菌的生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響

1.5.1pH值對(duì)苜蓿假盤(pán)菌生長(zhǎng)的影響 選用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為20%V8汁碳酸鈣瓊脂培養(yǎng)基。用1 mol/L的鹽酸和1 mol/L的氫氧化鈉將培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)為2.0、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0、10.0，共11個(gè)梯度。培養(yǎng)條件為20 ℃暗培養(yǎng)，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)、測(cè)量菌落直徑，并顯微觀察菌落產(chǎn)盤(pán)情況，每一處理至少鏡檢100個(gè)菌落。

1.5.2pH值對(duì)苜蓿假盤(pán)菌孢子萌發(fā)的影響 吸取孢子懸浮液1.5 mL加入離心管，離心(1 000～5 000 r/min，10 min)，棄去上清液，取沉淀物少許，分別加入到滴有pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0和10.0培養(yǎng)基的凹玻片上，置于20 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，4 h后鏡檢子囊孢子萌發(fā)，計(jì)算孢子萌發(fā)率，每次至少鏡檢同一處理下的100個(gè)孢子的萌發(fā)情況，孢子萌發(fā)統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)：芽管長(zhǎng)度達(dá)孢子長(zhǎng)度的1/2以上即視為萌發(fā)。

1.6光照對(duì)苜蓿假盤(pán)菌生長(zhǎng)的影響 以pH值為6.5的20%V8汁碳酸鈣瓊脂培養(yǎng)基為接種用培養(yǎng)基，平板上接種15 mL孢子懸浮液，置于20 ℃下光周期分別為12 h光照+12 h黑暗、24 h光照、24 h黑暗環(huán)境下培養(yǎng)，30 d后測(cè)量其菌落直徑，顯微觀察菌落產(chǎn)盤(pán)情況，每一處理至少鏡檢100個(gè)菌落。

1.7苜蓿假盤(pán)菌對(duì)碳源的利用 以PA[馬鈴薯(Solanumtuberosum)、瓊脂]培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，稱取1.5 g葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘油5種碳源分別加入100 mL PA培養(yǎng)基中，制成含有不同碳源的固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件同1.3。

1.8苜蓿假盤(pán)菌對(duì)氮源的利用 以PA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，稱取0.1 g硝酸鈉、硝酸銨、尿素、硫酸銨、草酸銨、L-苯丙氨酸、氨基乙酸、牛肉膏、酵母提取物和蛋白胨10種氮源分別加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，制成含有不同氮源的固體和液體培養(yǎng)基100 mL。固體培養(yǎng)基培養(yǎng)條件同1.3，液體培養(yǎng)基置于20 ℃、黑暗、振蕩條件下培養(yǎng)30 d后稱量。

1.9苜蓿假盤(pán)菌對(duì)無(wú)機(jī)鹽的利用 以PDA(馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，稱取0.1 g FeSO4、KCl、KH2PO4、MgSO44種無(wú)機(jī)鹽分別加入100 mL PDA培養(yǎng)基中，制成含有不同無(wú)機(jī)鹽的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件同1.8。

2 結(jié)果

2.1溫度對(duì)苜蓿假盤(pán)菌生長(zhǎng)的影響 該菌在5～35 ℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，低于5 ℃和高于35 ℃時(shí)不生長(zhǎng)，5 ℃時(shí)生長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)20 d后肉眼觀察培養(yǎng)基上出現(xiàn)針尖狀菌落。最適溫度20～25 ℃，生長(zhǎng)15 d的菌落直徑為1.54 mm(圖1)。

圖1 生長(zhǎng)30 d后不同溫度下苜蓿假盤(pán)菌菌落生長(zhǎng)情況

2.2水分對(duì)苜蓿假盤(pán)菌子囊孢子釋放、萌發(fā)的影響

2.2.1水分對(duì)苜蓿假盤(pán)菌子囊孢子釋放的影響 研究結(jié)果表明，在有游離水的培養(yǎng)皿內(nèi)，從原來(lái)的培養(yǎng)基中挑出的菌落能夠釋放出大量的子囊孢子，且自然彈射出的子囊孢子降落在菌落周?chē)呐囵B(yǎng)基上，并進(jìn)一步發(fā)育為子代菌落(圖2a)，子代菌落較小，顯微觀察(圖2b)98%以上的子代菌落都能發(fā)育成完整的子囊盤(pán)形成子囊和子囊孢子。無(wú)游離水的培養(yǎng)皿內(nèi)部分菌落彈射出孢子，沒(méi)有移出的原培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落幾乎沒(méi)有孢子釋放，僅有極個(gè)別的菌落有孢子彈射的現(xiàn)象，表明水分是制約子囊盤(pán)孢子釋放量大小的重要因素。

2.2.2水分對(duì)苜蓿假盤(pán)菌子囊孢子萌發(fā)的影響 葉片表面的游離水及游離水保持的時(shí)間直接影響孢子的萌發(fā)。在無(wú)游離水的條件下，孢子基本不萌發(fā)(圖3)。游離水維持4 h，孢子萌發(fā)率達(dá)75%，維持6 h，孢子萌發(fā)率達(dá)95%以上，隨濕度保持時(shí)間的增加，孢子萌發(fā)率逐漸增加。孢子萌發(fā)產(chǎn)生的芽管及其結(jié)構(gòu)如圖4所示。

圖2 菌落的彈射現(xiàn)象及擴(kuò)繁后的子代菌落

圖3 水分對(duì)苜蓿假盤(pán)菌子囊孢子萌發(fā)的影響

圖4 萌發(fā)的芽管及其頂端產(chǎn)生的分支

2.3pH值對(duì)苜蓿假盤(pán)菌生長(zhǎng)和子囊孢子萌發(fā)的影響

2.3.1pH值對(duì)苜蓿假盤(pán)菌生長(zhǎng)的影響 該菌在pH值4.0～10.0都能生長(zhǎng)，以5.0～8.0生長(zhǎng)較好。不論是菌落數(shù)還是形成子囊盤(pán)，均以pH值6.0和6.5為最佳，其子囊成熟率達(dá)90%，菌落數(shù)為100個(gè)左右，表明該菌pH值的生長(zhǎng)范圍較寬，從產(chǎn)生子囊盤(pán)看，pH值4.0和pH值10.0下幾乎不形成子囊盤(pán)，以pH值6.0～6.5為產(chǎn)盤(pán)率最高(表1)。試驗(yàn)表明，該菌進(jìn)行有性生殖所需要的pH值較窄。pH值1.0、2.0、3.0培養(yǎng)基未凝固，故未進(jìn)行接種。分析顯示，不同pH值對(duì)苜蓿假盤(pán)菌子囊盤(pán)成熟率的影響尤為明顯。

表1 不同pH值對(duì)苜蓿假盤(pán)菌菌落生長(zhǎng)的影響

2.3.2pH值對(duì)苜蓿假盤(pán)菌子囊孢子萌發(fā)的影響 子囊孢子在pH值2.0～10.0范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，最適pH值5.0～6.5，pH值6.0時(shí)萌發(fā)率最高達(dá)64%，pH值低于5.0或高于6.5，萌發(fā)率呈下降趨勢(shì)(圖5)。表明弱酸條件下有利于病菌子囊孢子的萌發(fā)。

2.4光照對(duì)苜蓿假盤(pán)菌生長(zhǎng)的影響 不同光照條件對(duì)病菌的生長(zhǎng)影響較大，表現(xiàn)在隨光照強(qiáng)度的增加，菌落生長(zhǎng)呈明顯的下降趨勢(shì)。以黑暗下生長(zhǎng)最好，全光照條件下生長(zhǎng)最差。病菌在全光照條件下，菌落數(shù)極少，僅為5個(gè)，顯微觀察菌絲形態(tài)，可見(jiàn)菌絲中有球形膨大體，雖有子囊盤(pán)結(jié)構(gòu)，但未觀察到分化的子囊；半光照條件下，菌落數(shù)為65個(gè)，菌落直徑為0.8 mm，顯微觀察，菌絲中有完整的子囊盤(pán)和分化出的子囊，但子囊孢子分化不明顯；黑暗條件下菌落數(shù)和菌落直徑的生長(zhǎng)均明顯優(yōu)于有光照的條件，顯微觀察，子囊盤(pán)發(fā)達(dá)，著生在盤(pán)上的子囊排列整齊，子囊內(nèi)可見(jiàn)明顯的子囊孢子(表2)。表明光照既不利于病菌生長(zhǎng)，也不利于病菌的有性生殖。

圖5 不同pH值對(duì)苜蓿假盤(pán)菌子囊孢子萌發(fā)的影響

表2 不同光照對(duì)苜蓿假盤(pán)菌生長(zhǎng)的影響

2.5碳源對(duì)苜蓿假盤(pán)菌生長(zhǎng)的影響 該菌能利用固體培養(yǎng)基上不同的碳源，但利用能力上有顯著差別。病菌對(duì)葡萄糖和麥芽糖的利用較好，形成的菌落量大。葡萄糖下只形成黑色菌落，且產(chǎn)盤(pán)率達(dá)86%；麥芽糖中形成黑色和土黃色2種顏色的菌落，其中黑色菌落產(chǎn)盤(pán)率為81%，土黃色菌落不形成子囊盤(pán)；蔗糖形成土黃色菌落，不形成子囊盤(pán)；甘油形成黑色和土黃色2種顏色的菌落，其中黑色菌落產(chǎn)盤(pán)率為28%，土黃色菌落不產(chǎn)盤(pán)(表3)。不同碳源條件下，菌落顏色不同。乳糖培養(yǎng)基上不形成子囊盤(pán)。表明葡萄糖和麥芽糖不僅有利于病菌的生長(zhǎng)，且有利于病菌進(jìn)行有性生殖，乳糖抑制有性生殖。

表3 不同碳源對(duì)苜蓿假盤(pán)菌菌落生長(zhǎng)的影響

2.6氮源對(duì)苜蓿假盤(pán)菌生長(zhǎng)的影響 在固體培養(yǎng)基上，10種供試氮源中，除尿素外，該菌均能不同程度利用無(wú)機(jī)氮源和有機(jī)氮源。菌落直徑和生長(zhǎng)速率基本一致，差異不顯著，菌落數(shù)差別較大，無(wú)機(jī)氮源優(yōu)于有機(jī)氮源，表明該菌對(duì)無(wú)機(jī)氮源的利用能力強(qiáng)于有機(jī)氮源(表4)。在液體培養(yǎng)基中，病菌除不能利用氨基乙酸和尿素外，對(duì)其余8種氮源均能利用。有機(jī)氮源優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源，表明液體培養(yǎng)條件下，病菌對(duì)有機(jī)氮源的利用能力強(qiáng)于無(wú)機(jī)氮源。無(wú)論是固體培養(yǎng)還是液體培養(yǎng)，尿素均抑制病菌的生長(zhǎng)。

表4 不同氮源對(duì)苜蓿假盤(pán)菌生長(zhǎng)的影響

2.7無(wú)機(jī)鹽對(duì)苜蓿假盤(pán)菌生長(zhǎng)的影響 供試的4種鹽溶液，除KH2PO4沒(méi)有菌落生長(zhǎng)外，其余3種鹽溶液下菌落生長(zhǎng)較好，且生長(zhǎng)量基本一致，F(xiàn)eSO4生長(zhǎng)量為42.9 g，KCl生長(zhǎng)量為43.3 g，MgSO4生長(zhǎng)量為43.3 g。肉眼觀察，培養(yǎng)液中菌落均不懸浮，互相粘連，黏著于培養(yǎng)瓶的底部。顯微觀察，發(fā)現(xiàn)這4種鹽溶液下生長(zhǎng)的菌落均不產(chǎn)生子囊盤(pán)。表明無(wú)機(jī)鹽對(duì)該菌的有性生殖不是必需的。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)中利用組織塊分離法亦分離出了苜蓿假盤(pán)菌菌株，與袁慶華等[4]報(bào)道有異，pH值大于6.0時(shí)，苜蓿假盤(pán)菌寧夏菌株亦產(chǎn)盤(pán)。分離菌株選用V8汁碳酸鈣瓊脂培養(yǎng)基，其上亦有粉紅菌落的產(chǎn)生，王薊華等[6]亦有相同報(bào)道，且擴(kuò)繁時(shí)該顏色菌落只產(chǎn)生粉紅色的子代菌。當(dāng)供試碳源為葡萄糖時(shí)，僅有黑色菌落出現(xiàn)，為蔗糖和乳糖時(shí)，僅有土黃色菌落出現(xiàn)，為麥芽糖和甘油時(shí)2種顏色均有，表明碳源對(duì)菌落的顏色影響很直接?？蛇M(jìn)一步研究顏色分化與致病力的關(guān)聯(lián)性，篩選弱毒性菌株，對(duì)其致病力分化作分子生物學(xué)上的深入研究。

苜蓿假盤(pán)菌寧夏菌株對(duì)生態(tài)條件的適應(yīng)范圍較廣，在5～35 ℃，pH值4.0～10.0均能生長(zhǎng)，但是尿素能抑制該菌的生長(zhǎng)，鹽溶液中KH2PO4沒(méi)有菌生長(zhǎng)，從有性生殖角度來(lái)看，4種鹽溶液下生長(zhǎng)的菌落均不產(chǎn)生子囊盤(pán)，pH值亦是其進(jìn)行有性生殖的主要限制因素。故該菌對(duì)有性生殖的條件是極其嚴(yán)格的，利用這些特性可為該病害的無(wú)公害防治提供思路。

苜蓿假盤(pán)菌隨光照強(qiáng)度的增加，生長(zhǎng)受到抑制，說(shuō)明不同緯度和季節(jié)的光照狀況對(duì)病菌的生長(zhǎng)有影響。據(jù)報(bào)道[9]，病菌致病力在地理上存在分化現(xiàn)象，且該菌是一種易發(fā)生變異的真菌[4]，今后應(yīng)加強(qiáng)寧夏菌株與寄主互作過(guò)程中病菌變異的遺傳基礎(chǔ)及群體遺傳結(jié)構(gòu)變異機(jī)制的研究，特別是分子機(jī)制上的研究。

本研究結(jié)果表明，水分是病菌子囊孢子釋放和萌發(fā)的關(guān)鍵。病菌的這種對(duì)水分的特殊要求與寧夏南部山區(qū)苜蓿褐斑病發(fā)生和流行條件相一致，這也可以解釋寧夏南部山區(qū)苜蓿褐斑病發(fā)生和流行重于川區(qū)的原因，同時(shí)也說(shuō)明為何雨后苜蓿褐斑病容易爆發(fā)和流行，明確這一規(guī)律為田間該病害流行的預(yù)警發(fā)布提供依據(jù)。

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