張庭瑞，李志忠

(蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050)

鎖陽(Cynomoriumsongaricum)又名鐵棒槌、銹鐵棒、地毛球等，是鎖陽科鎖陽屬的單科單屬單種植物，多寄生于蒺藜科白刺屬(Nitraria)植物的根部，屬全寄生種子植物。系多年生肉質(zhì)草本，無葉綠素，呈紫紅色，大部埋于沙中。鎖陽中含大量黃酮類化合物[1]。黃酮類化合物具有抗自由基、抗氧化、抗癌、抗菌等多種生理活性及藥理作用[2]，且無毒無害，對(duì)人類的腫瘤、衰老、心血管病等疾病的治療和預(yù)防有重要意義，還被用作食品、化妝品天然添加劑，如甜味劑、抗氧化劑和食用色素等[3-4]，因此，成為近年研究、開發(fā)和利用的熱點(diǎn)[5-7]。目前國內(nèi)外文獻(xiàn)尚未見對(duì)鎖陽總黃酮純化的報(bào)道。黃酮類化合物最常用的純化方法為層析柱法，主要利用大孔樹脂作為吸附材料。大孔吸附樹脂是20世紀(jì)60年代初開發(fā)的一類有機(jī)高聚物吸附劑，大孔吸附樹脂分離技術(shù)的應(yīng)用原理主要是利用其吸附性和分子篩作用相結(jié)合，依靠其物理性質(zhì)(如比表面積、孔徑等)選擇性地吸附藥液中有效成分并去除雜質(zhì)。特點(diǎn)是吸附容量大、再生簡單、效果可靠[8]。大孔吸附樹脂分離技術(shù)被認(rèn)為是提取分離中草藥中水溶性成分的一種有效方法[9]。該技術(shù)已比較廣泛地應(yīng)用到中藥新藥的開發(fā)和中成藥的生產(chǎn)中，主要用于分離和提純苷類、黃酮類、生物堿成分及其大規(guī)模生產(chǎn)[10]。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 鎖陽干燥肉質(zhì)莖(甘肅酒泉產(chǎn))、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和AB-8型大孔吸附樹脂分別由甘肅酒泉市金鎖陽天然保健品有限公司、中國藥品生物制品檢定所和南開大學(xué)化工廠提供；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、鹽酸、氯仿均為分析純，甲醇為優(yōu)級(jí)純。

主要儀器設(shè)備包括：UV-9200型紫外可見分光光度計(jì)；AB104-N型電子分析天平；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋；TG16型高速臺(tái)式離心機(jī)；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵；RE 52-88A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；電子調(diào)劑萬用電爐；Galanz WP750型微波爐；JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)；BS-2F型振蕩培養(yǎng)箱；層析柱(Ф 15 mm×450 mm)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1樣品處理 用清水沖洗干凈，置于干燥箱中60 ℃恒溫干燥30 min，取出冷卻后粉碎，過0.15 mm篩，置干燥器中備用。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以Na(NO3)2-Al(NO3)3-NaOH絡(luò)合顯色分光光度法在510 nm波長處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[11-12]。得回歸方程y=1.177 9x+0.005 2(r=0.999 75)和蘆丁含量y與吸光度x之間的回歸曲線(圖1)。

1.2.3AB-8型大孔吸附樹脂預(yù)處理 按下列步驟進(jìn)行預(yù)處理：將樹脂以95%工業(yè)乙醇浸泡24 h后濕法裝柱；用95%工業(yè)乙醇沖洗(流速2 BV/h，BV為樹脂體積倍數(shù))洗至流出液與水以1∶2混合不產(chǎn)生混濁時(shí)，再用大量蒸餾水洗至洗液澄清；用2 BV 5% HCl液沖洗樹脂柱(流速4～6 BV/h)，然后用水以同樣流速洗至中性；用2 BV 2% NaOH液沖洗樹脂柱(流速4～6 BV/h)，然后用水同樣流速洗至中性[13]。

圖1 蘆丁對(duì)照品回歸曲線

1.2.4AB-8型大孔吸附樹脂純化粗提液 取備用鎖陽30 g，以70%乙醇600 mL在80 ℃下回流1.5 h，以500 W、20 s/20 s、60 s的條件超聲波處理2次；再以80 ℃回流1.5 h；減壓抽濾，并用少量30%乙醇溶液洗滌濾渣，合并濾液；在45 ℃下減壓蒸餾，除去其中的乙醇；將濃縮液以75 mL氯仿分3次萃取脫脂，待完全分層后，收集每次水溶液；離心，取上清液，作為供試液備用。

1.2.5樹脂比吸附量的測(cè)定 取預(yù)處理的干樹脂43 g，裝入500 mL碘量瓶中，加入供試液185.6 mL，恒溫25 ℃，150 r/min，振搖吸附24 h。在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、23、24 h時(shí)吸取上清液，測(cè)定樣品中的總黃酮含量。

按公式A=(C1-C2)×V/W計(jì)算在t時(shí)刻內(nèi)樹脂對(duì)鎖陽總黃酮的比吸附量。式中，A為比吸附量(mg/g)；C1為吸附前供試液質(zhì)量濃度(mg/mL)；C2為吸附后上清液質(zhì)量濃度(mg/mL)；V為樣品液體積(mL)；W為干樹脂質(zhì)量(g)。按照“標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制”項(xiàng)下的方法精密量取相應(yīng)體積的稀釋液進(jìn)行處理，測(cè)定吸光度[13]。

1.2.6比洗脫量的測(cè)定 將上述充分吸附后的樹脂，裝入層析柱內(nèi)，樹脂柱用120 mL蒸餾水沖洗后，用70%的乙醇洗脫，流速1 mL/min，收集乙醇洗脫液，測(cè)定其中所含的黃酮量[13]。

M=(C×V)/W式中，M為比洗脫量(mg/g)；C為洗脫液質(zhì)量濃度(mg/mL)；V為樣品液體積(mL)；W為樹脂質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果

AB-8型大孔樹脂吸附10 h后對(duì)鎖陽總黃酮的比吸附量超過70%，最終穩(wěn)定比吸附量達(dá)81.933 mg/g(表1)，鎖陽提取液純化后純度達(dá)到972.775 mg/g，即97.278%。樹脂吸附達(dá)到飽和大約需10 h，且由最終洗脫液質(zhì)量濃度可得出該樹脂對(duì)鎖陽總黃酮的比洗脫量，最高可達(dá)53.164 mg/g。

表1 大孔吸附樹脂吸附濃度、純化結(jié)果及分析

3 討論與結(jié)論

黃酮類化合物是具有酚羥基的兩個(gè)苯環(huán)(A，B環(huán))通過中央3個(gè)碳原子連接而成的一系列化合物，植物體內(nèi)大部分與糖結(jié)合成苷類或碳糖基存在，有的以游離形式存在[5]。黃酮類化合物的溶解度因結(jié)構(gòu)及存在狀態(tài)(苷或苷元、單糖苷、雙糖苷或三糖苷)不同而存在差異，一般游離苷元難溶或不溶于水，易溶于乙醇、甲醇等有機(jī)溶劑及稀堿中，其中黃酮、黃酮醇、查爾酮等平面型黃酮類化合物分子間引力較大，難溶于水；而二氫黃酮、二氫黃酮醇及異黃酮等非平面型黃酮類化合物處于半椅子式結(jié)構(gòu)，破壞了分子的平面性，分子間引力較小，其水溶性大于上述平面型黃酮類化合物。黃酮類化合物糖苷化后，水溶性增加，脂溶性降低，一般易溶于熱水、甲醇、乙醇、稀堿溶液，而難溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚等親脂性有機(jī)溶劑[14]。游離黃酮及黃酮苷一般都含酚羥基，故都可溶于堿中，加酸后又沉淀出來，可利用此性質(zhì)提取、分離黃酮類化合物[15]。本研究利用黃酮類化合物易溶于乙醇的特性，采用不同濃度和條件對(duì)其進(jìn)行提純。

大孔吸附樹脂為吸附和篩選原理相結(jié)合的分離材料，其吸附力與樹脂的比表面積、表面電性、能否與被吸附物形成氫鍵等有關(guān)，篩選原理是由于本身多孔性結(jié)構(gòu)所決定[16]。在確定分離條件時(shí)，首先根據(jù)黃酮類化合物分子體積大小選擇了相適應(yīng)的大孔吸附樹脂，其次根據(jù)黃酮類化合物中含有酚羥基確定了樹脂的型號(hào)(AB-8)和分離條件。洗脫劑選擇了最常用且極性較小的乙醇，因?yàn)閷?duì)非極性的大孔吸附樹脂，洗脫劑極性越小，洗脫能力越強(qiáng)[17]。

本研究利用AB-8型大孔樹脂對(duì)鎖陽提取液純化后，黃酮類化合物(即總黃酮)純度達(dá)到97.278%，比洗脫量可達(dá)到53.164 mg/g。表明AB-8型大孔樹脂對(duì)鎖陽總黃酮具有極好的吸附性能，用其純化鎖陽黃酮類化合物是可行的。同時(shí)，由于AB-8型大孔吸附樹脂具有吸附快、吸附容量大、洗脫率高、再生簡單、能多次重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)[18]，而且本試驗(yàn)具有設(shè)計(jì)簡單易操作，藥品普通易配備，方法標(biāo)準(zhǔn)易實(shí)現(xiàn)等明顯優(yōu)勢(shì)，因此具有較高的重現(xiàn)性。

綜合評(píng)價(jià)，AB-8型大孔吸附樹脂對(duì)鎖陽總黃酮吸附性能和解吸性能均好，具有較高的比吸附量、吸附速度和比洗脫量，且純化能力極強(qiáng)。說明弱極性的樹脂適合用于鎖陽總黃酮的分離純化。為使樹脂吸附法成功地應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，除選用性能優(yōu)良的吸附劑外，還要配合最佳的動(dòng)態(tài)條件，才能獲得滿意的純化產(chǎn)物和分離效率，對(duì)此還需要進(jìn)一步研究。

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