王曉彥 孔繁榮 連 石

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚性病科，呼和浩特 010050;2.澳大利亞悉尼大學(xué)Westmead醫(yī)院微生物與感染中心，悉尼 NSW2145;3.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院皮膚性病科，北京 100053)

奴卡菌于1988年被發(fā)現(xiàn)，可導(dǎo)致由小牛鼻疽(淋巴結(jié)炎)［1］。奴卡菌是革蘭陽性需氧菌，常具抗酸性，屬于放線菌目，作為腐生菌存在于水、土壤、灰塵、腐爛的植物及動物的排泄物中［2］。奴卡菌病是由奴卡菌引起的一種少見但感染嚴重的疾病，該菌經(jīng)呼吸道入侵，也可經(jīng)皮膚、消化道入侵，通常呈亞急性或慢性化膿性疾?。?］。到目前為止，通過表型分析和分子生物學(xué)方法已發(fā)現(xiàn)奴卡菌有80多種［4］。大約有一半是致病菌，可感染人和(或)動物。

有報道［5］表明采用 hsp65，secA1及 gyrB 可以鑒別奴卡菌種的多態(tài)性。目前16S rDNA基因測序分析被作為奴卡菌種的金標準。大多數(shù)奴卡菌16S rDNA基因序列存儲于公共基因數(shù)據(jù)庫GenBank中［6］。但由于16S rDNA序列在原核生物中的高度保守性，對于相近種或同一物種內(nèi)的不同菌株之間的鑒別分辨力較差;16S～23S rDNA間隔區(qū)由于沒有特定功能和進化速率比16S rDNA大十多倍，近幾年在細菌鑒定和分類方面?zhèn)涫荜P(guān)注，成為研究的熱點，與16S rDNA相比，16S～23S rDNA間隔區(qū)序列更長且更具有多態(tài)性，在鑒別與奴卡菌極相似的菌種上具有潛在的應(yīng)用價值［7］。目前關(guān)于奴卡菌16S～23S rDNA間區(qū)有多少拷貝數(shù)及多少變異還知之甚少。

本試驗的目的是對5種少見的奴卡菌(Nocardia beijingensis，N.blacklockiae，N.thailandica，N.elegans以及N.vinacea)進行菌種鑒定及在種內(nèi)識別不同的基因型及逆向線點雜交(reverse line blot，RLB)型，評估RLB分型法在鑒別5個少見奴卡菌種中的敏感性，觀察16S～23S rDNA間區(qū)不同拷貝數(shù)對于奴卡菌種分型是否能提供依據(jù);另外，通過本試驗篩查奴卡菌種特異的RLB探針，建立可以大量篩查奴卡菌種的PCR/RLB方法，以進行快速臨床診斷及流行病學(xué)研究。

1 材料和方法

1.1 標本來源及培養(yǎng)

收集141株奴卡菌臨床標本，標本來源于澳大利亞Westmead醫(yī)院感染性疾病及微生物研究中心，其中有6例特殊的臨床標本，包括5種奴卡菌種，即N.beijingensis 2 株，N.blacklockiae，N.elegans，N.thailandica以及N.vinacea(表1)。135株其他奴卡菌種(表2)。

表1 5種經(jīng)過克隆的奴卡菌種ITS PCR產(chǎn)物進行基因測序、RLB雜交并與606 bp 16S rDNA基因序列比較結(jié)果Tab.1 Sequence types and identification of cloned PCR products of Nocardia beijingensis，N.blacklockiae，N.elegans，N.thailandica and N.vinacea isolates by ITS sequencing and ITS-based RLB hybridization in comparison with 606 bp 16S rDNA gene sequencing

ITS:internal transcribed spacer;RLB:reverse line blot;ID:identification;* The sequence type clone of N－bla seq Ⅴ failed tohybridize with any of the N.blacklockiae－specific probes but weakly cross－h(huán)ybridized with the‘Nvin－ⅠTS－c’probe;＊＊ The sequence type clone of N－tha seq Ⅳ failed to hybridize with all N.thailandica－specific probes.

表2 試驗中所用的寡核苷酸引物和探針Tab.2 Oligonucleotide primers and probes

臨床標本都進行了接種培養(yǎng)。微生物在BHI肉湯培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)3～10 d后進行 DNA提取［8］。DNA提取步驟如前所述［6］。提取出的奴卡菌DNA以400 μL TE(含有 5 mmol/L Tris HCl，0.5 mmol/L EDTA)緩沖液稀釋，并離心5 min以完全去除細胞碎片。含有奴卡菌上清的懸液用分光光度計定量并儲存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 奴卡菌ITS間區(qū)PCR

一對引物16S f及23S r用于擴增奴卡菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)區(qū)域。引物為自行設(shè)計，在北京奧科生物技術(shù)有限公司合成，PCR擴增步驟按以前描述步驟進行［9］。反應(yīng)體系含有10×緩沖液 2.5 μL，1.5 mmol/L MgCl21.0 μL，0.2 mmol/L dNTP(dATP，dGTP，dCTP，and dUTP)2.0 μL，上下游引物各 0.3 μL(50 pmol/μL)，0.75 U 熱啟動Taq酶 0.2 μL(澳大利亞QIAGEN有限公司)，1.0 μL 的 DNA，總體積 25 μL。在 Mastercycler gradient thermocycler(德國 Eppendorf GmbH)，95℃ 預(yù)變性15 min，然后94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物6～8 μL用SYBR safeTMDNA凝膠染液染色，在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳。

取PCR產(chǎn)物大小為614～651 bp，包括216 bp 3'端16S rRNA基因，328～365 bp的ITS間區(qū)以及70 bp 5'端23S rRNA基因，進行下一步ITS間區(qū)克隆。

1.3 奴卡菌ITS間區(qū)克隆

對擴增出來的符合要求的ITS間區(qū)PCR產(chǎn)物用pGEM－T Easy Vector SystemⅡ(美國Promega公司)進行克隆，以減少由于ITS拷貝或操縱子多樣性造成的基因序列異質(zhì)性的影響。將培養(yǎng)皿放于37℃溫室中培養(yǎng)十余小時后挑選白色單個大菌落劃線接種于LB培養(yǎng)基，每個菌種劃30條線，37℃培養(yǎng)10余小時后提取奴卡菌DNA。

再進一步用引物 PGEMT－A及 PGEMT－B證實614～651堿基插入是否存在(表2)。每一菌株克隆出16～25個克隆，挑選其中8～15個克隆進行基因測序，采用純化試劑盒純化(美國 Biomiga公司，V1260－1型)，進一步確定插入的堿基序列。同時用BigDye終結(jié)器(3.1版本)循環(huán)測序試劑盒(ABI Prism 373 genetic analyzer;美國Applied Biosystems)進行測序。

檢查每一個克隆的基因序列圖，基因序列采用BioManager(澳大利亞ANGIS信息服務(wù))軟件設(shè)備進行分析。共有基因序列從基因序列平面圖獲得，用Clustal W軟件使模糊堿基分布一致［10］。

1.4 探針設(shè)計

把ITS基因序列對齊以判定奴卡菌種特異性核苷酸多態(tài)性的特征。對每一奴卡菌種及不同的ITS操縱子，設(shè)計多個種特異探針(表2)。另外，設(shè)計2個放線菌特異的探針 ACTMY－ITS－a 和 ACTMY－ITS－b以捕獲及標記所有奴卡菌分離物及克隆的ITS PCR產(chǎn)物［9］(表2)。所有的探針經(jīng)過Sigma DNA計算器(http:∥www.sigma－genosys.com/calc/dnacalc.asp)判定都具有相似的物理特性。探針都用5'－己胺標記，并由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成。

1.5 PCR/RLB 試驗

1)RLB試驗前做PCR:反應(yīng)體系總體積30 μL。在Mastercycler gradient thermocycler上操作。存于4℃冰箱備用。23S rb為生物素標記(表2)。

所有菌株都做RLB檢測。所有病例都經(jīng)過了標準表型分類法［8］及部分16S rRNA(5'端606 bp片段)基因測序，并與GenBank數(shù)據(jù)庫中奴卡菌標準株序列經(jīng)過比較的種識別方法［6，9］(表 2)。

2)RLB雜交試驗:標RLB膜及RLB試驗如文獻［11］所述。

2 結(jié)果

2.1 經(jīng)過ITS間區(qū)克隆的奴卡菌PCR產(chǎn)物基因測序及其基因序列型分析

擴增這5種奴卡菌ITS區(qū)，所用引物詳見表2。每一例PCR產(chǎn)物長度要達到614～651 bp，本試驗獲得108個理想的克隆，分別為2株N.beijingensis 15和12個克隆，N.blacklockiae有25個克隆，N.elegans有18個克隆，N.thailandica有22個克隆，N.vinacea有12個克隆。所有理想的克隆都做了RLB試驗。108個克隆中的70個做了測序，其中包括N.beijingensis各有15和12個，N.blacklockiae有12個，N.elegans有14個，N.thailandica有8個，N.vinacea有9個。結(jié)果顯示2株N.beijingensis各有4個基因序列型，N.blacklockiae，N.elegans及N.thailandica各有4個基因序列型，N.vinacea有5個基因序列型(表1)。ITS基因序列型多樣性的位點詳見圖1。經(jīng)過RLB試驗，可以看到N.blacklockiae及N.thailandica還存在進一步的基因分型。N.blacklockiae含有3個ITS型，N.thailandica含有4個ITS型(表1)。

2.2 通過RLB試驗認識奴卡菌種及分型

2個放線菌特異的探針ACTMY－ITS－a及ACTMYITS－b與克隆的含有614～651 bp堿基及6個臨床分離物的DNA PCR產(chǎn)物雜交。這些被標記的DNA產(chǎn)物有可能是新的奴卡菌屬。采用多個種特異或操縱子特異的探針(表2)，這6例分離物的多數(shù)克隆(102/108，94.4%)通過RLB試驗可以準確認識(表1)。然而，N.blacklockiae(菌株96－247－0894)25 個克隆產(chǎn)物，其中4個與所有Nbla－ITS探針沒有雜交信號，相反，僅與 Nvin－ITS－c探針產(chǎn)生微弱的雜交信號(圖1，第1～3及第9道)。檢查奴卡菌ITS基因位點表明含有新的基因序列區(qū)。代表N.blacklockiaeⅤ型(N－bla seqⅤ，GenBank accession number GQ853495;表1)不能與N.blacklockiae的特異性探針雜交。N.thailandica 22個克隆，其中2個與N.thailandica特異性探針沒有雜交信號。所產(chǎn)生的基因序列也代表一個新的基因序列型(N－tha seqⅣ，GenBank accession number GQ853478;表1)。所有6個臨床標本都做了RLB分析，通過檢測得到了正確認識。這5種奴卡菌中以 N.beijingensis－ITS，N.blacklockiae－ITS 及 N.elegans－ITS的探針具有高度特異性。交叉雜交信號見于Nvin－ITS－c 以及 4 個 N.blacklockiae 克隆，Ntha－ITS－a探針及11株N.elegans克隆(圖1)。對照組RLB試驗發(fā)現(xiàn)3個N.elegans特異的探針與一些N.nova，N.veterana菌種有雜交反應(yīng)，而且 Nbei－ITS－d 探針與N.asteroides，N.cyriacigerogica一些菌株有雜交反應(yīng)(表2)。以上表明這些菌種可能具有類似的ITS操縱子基因序列，或至少在探針設(shè)計的序列附近。

通過“巨列陣”RLB檢測法能夠認識6個新的ITS型，表明為尋找新的ITS基因序列型可以做RLB試驗。

2.3 奴卡菌RLB型

許多特異的奴卡菌RLB分型，可以從其與特異的探針有雜交信號得到判定。從這5種奴卡菌種克隆產(chǎn)物中可以觀察到(每一種含有2～4 RLB型，詳見表1，表3及圖1)，除了那6個含有新的ITS基因序列型克隆以外，每一份標本RLB型都較基因序列型少，但N.thailandica每一個ITS基因序列型都產(chǎn)生1個不同的RLB型(表1)。對臨床標本進行直接測序一般產(chǎn)生該基因序列所有型的組合。但N.beijingensis strain 03－294－3356 僅與 Nbei－ITS－a 及 Nbei－ITS－b 探針有反應(yīng)。

圖1 5種新出現(xiàn)的奴卡菌種克隆后PCR產(chǎn)物RLB雜交試驗結(jié)果Fig.1 RLB hybridization results for cloned PCR products of the five emerging Nocardia species

3 討論

上世紀50年代以來隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，細菌的分類鑒定也由傳統(tǒng)的表型分類法進入到各種基因型分類水平。rRNA是研究細菌進化和親緣關(guān)系的重要指標，在細菌中高度保守。16S～23S rDNA間區(qū)近年來在細菌系統(tǒng)發(fā)育學(xué)，特別是相近種和菌株的區(qū)分和鑒定方面?zhèn)涫荜P(guān)注［7］。但通過分子生物學(xué)方法認識新發(fā)現(xiàn)的奴卡菌及進行分類仍然存在一定困難［4］。雖然16S rRNA基因位點存在多樣性，但在識別奴卡菌種方面明顯存在不足［6，12］，那么就有必要檢測更多的細菌ITS間區(qū)以進一步認識奴卡菌種［9，13］。

在該研究中，本課題組提供了詳盡的基因序列資料以及5株新發(fā)現(xiàn)的奴卡菌ITS基因序列多樣性的資料。根據(jù)基因序列的多形性，建立了以ITS間區(qū)為基礎(chǔ)的RLB試驗以進一步認識這5株奴卡菌種。研究表明RLB試驗達到了94%的敏感性及特異性，有可能作為奴卡菌種進一步分型的潛在工具。

3.1 探針的研制

從克隆的PCR產(chǎn)物基因序列獲得的ITS基因序列隊列顯示存在3個不同的短基因序列2 3 1～3 0 4bp，328～385 bp及409～530 bp，這些序列隨著不同的克隆或基因序列可以發(fā)生明顯的變化。此外也可以看到種特異單核苷酸多態(tài)性。為鑒別種間及種內(nèi)的變化，所有這些核苷酸變化的位點都作為探針設(shè)計的依據(jù)(表2，圖1)。針對每一個種都存在多個基因序列型(表1)，存在多個(3～4個)基因序列型或操縱子特異的探針。這些探針結(jié)合起來能夠識別特異的奴卡菌種。

表3 奴卡菌ITS間區(qū)克隆的PCR產(chǎn)物RLB型Tab.3 RLB pattern types of all target Nocardia isolates and cloned PCR products tested in this study?，presence of hybridization signal

利用探針為基礎(chǔ)的方法認識細菌ITS基因序列型多樣性與Sadeghifard N等［14］報道一致，即艱難梭菌ITS操縱子具有鑲嵌的結(jié)構(gòu)特征，并且他們推測ITS基因序列的這種特征有可能發(fā)現(xiàn)新的基因序列型。通過本課題組的“巨列陣”RLB檢測法能夠認識6個新的ITS型，表明為尋找新的ITS基因序列型可以做RLB試驗。

3.2 檢測方法的特異性

RLB的特異性是通過檢測這5株奴卡菌(表3)及另外135株(14個種)奴卡菌而得到的(表2)。

本研究另一個關(guān)鍵是2株N.beijingensis在ITS區(qū)出現(xiàn)了不同的RLB型。關(guān)于這一點與本課題組最近的觀察一致:即N.farcinica能與多個不同的ITS RLB探針有雜交反應(yīng)，并且支持RLB模式可以作為奴卡菌分子生物學(xué)分型的工具［9］。進一步研究大量菌種需要進一步改進種特異探針設(shè)計以滿足不同的鑒別需求［14］。由于會遇到大量奴卡病原菌，DNA測序已經(jīng)成為鑒別菌種的首選方法。筆者認為16S rRNA基因測序很精確，可以正確識別這5株新出現(xiàn)的奴卡菌種［6］。然而，16S rRNA基因測序方法十分昂貴，而且受到基因序列數(shù)據(jù)庫質(zhì)量的限制。此外，由于存在多個ITS操縱子可以導(dǎo)致誤識。以探針為基礎(chǔ)的雜交技術(shù)可以鑒別分枝桿菌，但在鑒別奴卡菌種上還沒有建立成熟的方法［15］。RLB試驗可以同時采用多個探針分析多個標本，在這5株奴卡菌菌種中證實RLB可以達到和ITS測序一樣的敏感性。在本試驗中僅使用20個探針，一張膜中可以加43個標本，擴大了菌種檢測的范圍或基因測序的類型。

總之，本課題組第一次通過克隆試驗，準確的ITS基因測序資料認識了新出現(xiàn)的奴卡菌種，即N.beijingensis，N.blacklockiae，N.elegans，N.thailandica 和N.vinacea。每個菌種都具有多個ITS基因序列型。由于RLB試驗中有種特異或操縱子特異的探針，使認識每一菌種獨特的RLB型成為可能。PCR/RLB試驗有助于我們認識奴卡菌，并在基因分型研究中顯示了廣闊的發(fā)展前景。深入研究奴卡菌ITS位點多態(tài)性可以幫助我們對奴卡菌并進行進一步基因分型。

致謝:我們感謝澳大利亞悉尼Westmead Millenium Institute給我們提供測序?qū)嶒灄l件。

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