閆 峰 劉向榮 張 營 張陳誠 吉訓明 羅玉敏

(首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院腦血管病研究室，北京 100053)

腦血管病具有高發(fā)病率、高致殘率、高病死率、高復發(fā)率的特點，其中缺血性腦血管病的發(fā)病約占80%左右。目前關(guān)于腦缺血神經(jīng)損傷的保護研究很多［1－3］。多數(shù)基礎(chǔ)研究［4－5］表明缺血預適應對大鼠腦缺血具有保護作用。缺血預適應是在腦缺血之前給予非損傷性的缺血，大腦會產(chǎn)生對以后的嚴重缺血的保護。然而，由于疾病的不可預測性，科學家將視野轉(zhuǎn)向了缺血后適應，簡言之，與缺血預適應相對應，缺血后適應是在腦缺血后給予腦一個非損傷的缺血適應?！斑h隔缺血后適應”即:器官發(fā)生缺血后，對遠隔器官進行短暫的、非致死性缺血和再灌注，可以減輕器官的缺血再灌注損傷。由于腦本身對缺血的敏感，很難控制其缺血適應的程度，遠隔缺血后適應更容易應用于腦缺血的保護研究。已經(jīng)有研究［2－3，6－7］表明，缺血后適應以及遠隔缺血后適應對腦缺血損傷具有保護作用。應用大腦中動脈閉塞模型發(fā)現(xiàn)，其功能缺損是神經(jīng)元核周體和有髓軸突損傷的共同反應［8］。淀粉樣前體蛋白(β－amyloid precursor protein，β－APP)是一種廣泛存在于全身組織細胞，具有膜受體蛋白樣結(jié)構(gòu)的單跨膜蛋白［9］。近來，β－APP在缺血腦損傷中的表達以及作用機制受到越來越多地重視［10］。本文主要觀察了大鼠腦缺血后腦組織β－APP表達的變化以及遠隔缺血后適應對大鼠腦缺血再灌注后β－APP表達的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級雄性SD大鼠28只，體質(zhì)量280～300 g，購自北京維通利華實驗動物公司〔動物許可證號:SCXK(京)2006－2009〕。飼養(yǎng)于 SPF級動物室，自由進食進水。實驗前采用抽簽法隨機分為7組:①假手術(shù)組(S，n=4);② 缺血再灌注4 h組(C4，n=4);③缺血即刻后適應4 h組(I4，n=4);④ 再灌注即刻后適應4 h組(R4，n=4);⑤ 缺血再灌注24 h組(C24，n=4);⑥ 缺血即刻后適應24 h組(I24，n=4);⑦ 再灌注即刻后適應24 h組(R24，n=4)。

1.2 儀器

小動物呼吸機(Harvard Apparatus 683)、雙極電凝(德威，DEVEL，ACC100)、顯微鏡(Carl Zeiss OpmI－pico)、反饋式溫度調(diào)節(jié)儀(Harvard Apparatus)、血氣分析儀(美國，Abbott公司，i－STAT)、有創(chuàng)血壓監(jiān)測儀(Siemens公司SC600C)、激光多普勒腦血流儀(Perimed，PeriFlux System 5000)顯微手術(shù)器械。

1.3 動物模型制作

采用改良的ZeaLonga法制備大鼠腦缺血再灌注(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。大鼠稱體質(zhì)量后5%恩氟烷混合70%N2O、30%O2誘導麻醉，2%恩氟烷混合70%N2O、30%O2維持麻醉。頸正中切口分離右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈，使用頭端直徑為0.38 mm的尼龍線栓由頸外動脈殘端插入頸內(nèi)動脈，至距頸內(nèi)動脈和頸外動脈分叉處約18 cm，缺血時間為2 h。

使用反饋性控溫毯監(jiān)測大鼠肛溫，將大鼠體溫保持于36.5℃～37.5℃。分離大鼠尾動脈插入PE50管持續(xù)監(jiān)測血壓和血氣(pH，PO2，PCO2)。術(shù)中使用激光多普勒監(jiān)測腦血流以確保模型的成功。

1.4 遠隔缺血后適應方法

分離大鼠雙側(cè)股動脈主干，分別在缺血即刻和再灌注即刻使用動脈夾夾閉股動脈10 min，放開10 min，重復3次。假手術(shù)組和對照組僅分離股動脈，不夾閉。

1.5 免疫印跡

每組留取4只大鼠，在缺血再灌注4 h和24 h處死大鼠，留取缺血側(cè)腦組織。提取腦組織蛋白、測定蛋白濃度:腦組織于冰上加入裂解液，用超聲波細胞粉碎機進行勻漿，冰浴30 min，以12 000 r/min于4℃離心30 min，取上清。根據(jù)BCA法參照標準蛋白濃度，于560 nm處測定樣本的吸光度值(OA值)。根據(jù)標準蛋白曲線計算各樣本的蛋白含量。配制8%分離膠和5%積層膠，取60 μg蛋白樣品溶于相應體積的上樣液中，水浴鍋95℃～100℃加熱5 min，蛋白變性后即刻加樣。室溫下40 V電泳1 h，蛋白樣品到達分離膠后將電壓調(diào)為80 V，繼續(xù)電泳約3 h。配制電轉(zhuǎn)液，4℃下以60 V 120 min的條件下轉(zhuǎn)至預先用甲醇處理好的PVDF膜上。將膜置于TBST中清洗3次，每次10 min，置入5%脫脂牛奶中4℃封閉過夜。第2天將膜置入一抗中室溫孵育4 h，隨后TBST清洗3次，每次10 min，再置入二抗中室溫孵育1 h。抗體如下稀釋:抗 β－APP(1∶50，abcam 公司)、抗 actin(1∶2 000)、辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)標記山羊抗兔(1∶2 000)?；瘜W發(fā)光法檢測條帶。AlphaEaseFC軟件分析蛋白條帶的相對吸光度。

1.6 免疫熒光染色

每組留取4只大鼠，分別在缺血再灌注4 h和24 h處死大鼠，在大鼠腦模具中以視交叉開始冠狀位向前及后各留取2 mm厚的腦組織，石蠟包埋，切片，進行免疫熒光染色。步驟如下:腦組織切片依次進行二甲苯脫蠟、梯度乙醇入水，0.3%的H2O2/甲醇溶液消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，EDTA抗原微波熱修復12 min，小牛血清封閉非特異性抗原，4℃過夜;β－APP抗體(1∶50，Abcam 公司)，室溫 2 h;神經(jīng)元核抗原(Neuronal Nuclei，NeuN)抗體(1∶80，代表神經(jīng)元);神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體(1∶200，代表膠質(zhì)細胞)，1×PBS漂洗 3次，每次 3 min;加 TRITC(tetramethylrhodamineisothiocyanate)山羊抗兔IgG，室溫30 min;1×PBS漂洗3次，每次3 min;DAPI(4'，6－diamidino－2－phenylindole)封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計分析，所有資料用均數(shù)±標準差()表示，各數(shù)據(jù)組間比較使用單因素方差分析方法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 遠隔缺血后適應對大鼠腦缺血β-APP含量的影響

圖1為各組大鼠的電泳圖。通過計算每個標本β－APP與 β－actin的灰度比值，比較各組灰度比值(P=0.0201)。其中C24與I24兩組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。其余各組比較差異無統(tǒng)計學意義(圖2)。

圖1 遠隔缺血后適應對大鼠腦缺血后β-APP含量影響的免疫印跡電泳圖Fig.1 The effects of remote ischemic post-conditioning on the level of β-APP in rats following cerebral ischemia

2.2 遠隔缺血后適應對大鼠腦缺血β-APP蛋白表達的影響

為進一步探討β－APP蛋白表達的部位，我們應用免疫熒光雙染分別對β－APP/NeuN(代表神經(jīng)元)和β－APP/GFAP(代表膠質(zhì)細胞)進行分析，發(fā)現(xiàn)β－APP可以與神經(jīng)元共表達，同時發(fā)現(xiàn)軸突也有表達，神經(jīng)膠質(zhì)細胞表達較少(圖3，4)。為證明抗體的特異性我們用了陰性對照。β－APP/GFAP的陰性對照同β－APP/NeuN的陰性對照，圖片未列出。

圖2 遠隔缺血后適應對大鼠腦缺血后β-APP含量影響的定量分析Fig.2 The quantitative determination of the effects of remote ischemic post-conditioning on the level of β-APP in rats following cerebral ischemia

3 討論

β－APP廣泛存在于全身組織細胞，以神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞中含量較為豐富，正常情況下主要經(jīng)非淀粉樣蛋白生成途徑水解［9］，β－APP在神經(jīng)元中的主要作用是:①神經(jīng)營養(yǎng)作用;②促進神經(jīng)元突起長出和突觸發(fā)生作用;③ 對神經(jīng)興奮性和突觸可塑性的修飾［11］。β－APP在腦損傷時以淀粉樣蛋白生成途徑水解，產(chǎn)生Aβ。其可以直接激活補體系統(tǒng)，通過補體經(jīng)典途徑和形成膜攻擊復合體而產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，導致再灌注損傷。APP的神經(jīng)毒性主要是通過異常水解產(chǎn)生的Aβ所激發(fā)的［9］。

β－APP是通過軸突快速轉(zhuǎn)運機制運輸?shù)囊环N神經(jīng)元正常成分［9］，在正常神經(jīng)元中，它的表達水平很低，但在機械性損傷，缺血缺氧、興奮性毒素等引起的腦損傷后，β－APP可作為一種快速反應性蛋白而誘導增高，或者由于β－APP的軸突運輸被打斷而出現(xiàn) β－APP的聚集［9］。這種聚集由于缺血等損傷可引起神經(jīng)細胞內(nèi)氧自由基增加，Ca2+濃度異常升高。缺血狀態(tài)下，ATP合成減少，Na+－K+泵功能衰竭，谷氨酸轉(zhuǎn)運體系統(tǒng)反向轉(zhuǎn)運，導致Glu的釋放［12］。突觸間隙Glu濃度增加，并過度激活谷氨酸受體，尤其是NMDA受體。激發(fā)的氧化損傷等病理過程又可能活化β－分泌酶促進β－APP裂解，增加Aβ的產(chǎn)生和聚集。這些過程間形成了惡性循環(huán)，從而導致神經(jīng)元損傷和變性［13］。

本實驗結(jié)果表明，盡管大鼠腦缺血4 h以及24 h時，缺血腦組織β－APP水平與假手術(shù)組相比，P值均小于0.05，但從數(shù)值看，大鼠腦缺血再灌注后4 h β－APP水平未升高，24 h有升高，提示大鼠局灶性腦缺血模型中缺血腦組織β－APP的聚集在缺血后24 h開始，因此相關(guān)的保護治療可以在腦缺血24 h前開始。本實驗中缺血即刻給予遠隔缺血后適應組在24 h時缺血腦組織β－APP的水平顯著低于對照組，提示，遠隔缺血后適應可能通過干預β－APP的水平從而減少Aβ的產(chǎn)生和聚集，減少腦組織的損傷。最近有報道［14－16］，腦缺血后 β－APP 的表達變化與時間以及 Aβ的多少有關(guān)。

本實驗提示我們應該注意神經(jīng)元以外的白質(zhì)損傷，通過實施遠隔缺血后適應可能會降低腦缺血后β－APP水平的升高，從而減少缺血再灌注損傷。對非生命重要器官實施遠隔缺血后適應，來保護已經(jīng)發(fā)生缺血的生命重要器官，避免了對心、腦等生命重要器官直接實施缺血保護帶來的高風險，此種方法對于臨床應用具有重要意義。

［1］Fisher M.New approaches to neuroprotective drug development［J］.Stroke，2011，42(1):S24－27.

［2］宋兆晶，牛小媛，吉訓明，等.遠程缺血后適應對腦缺血損傷作用的實驗研究［J］.中國醫(yī)學創(chuàng)新雜志，2010，7(11):1－4.

［3］朱榆紅，吉訓明，李春艷，等.缺血后適應對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響［J］.中國病理生理雜志，2008，24(11):2151－2155.

［4］Durukan A，Tatlisumak T.Preconditioning－induced ischemic tolerance:a window into endogenous gearing for cerebroprotection［J］.Exp Transl Stroke Med，2010，2(1):2.

［5］Yannopoulos F S，M?kel? T，Niemel? E，et al.Improved cerebral recovery from hypothermic circulatory arrest after remote ischemic preconditioning［J］.Ann Thorac Surg，2010，90(1):182－188.

［6］Sandu N，Schaller B.Postconditioning:a new or old option after ischemic stroke?［J］.Expert Rev Cardiovasc Ther，2010，8(4):479－482.

［7］Xing B，Chen H，Zhang M，et al.Ischemic post－conditioning protects brain and reduces inflammation in a rat model of focal cerebral ischemia/reperfusion［J］.J Neurochem，2008，105(5):1737－1745.

［8］Lee E J，Lee M Y，Chen H Y.Melatonin attenuates gray and white matter damage in a mouse model of transient focal cerebral ischemia［J］.J Pineal Res，2005，38(1):42－52.

［9］Nihashi T，Inao S，Kajita Y，et al.Expression and distri－bution of beta amyloid precursor protein and beta amyloid peptide in reactive astrocytes after transient middle cerebral artery occlusion［J］.Acta Neurochir(Wien)，2001，143(3):287－295.

［10］Hiltunen M，van Groen T，Jolkkonen J.Functional roles of amyloid－beta protein precursor and amyloid－beta peptides:evidence from experimental studies［J］.J Alzheimers Dis，2009，18(2):401－412.

［11］李宗平.顱腦損傷后β－APP及其產(chǎn)物在腦組織中的變化及臨床意義［J］.國外醫(yī)學神經(jīng)病學神經(jīng)外科學分冊，2003，30(1):30－32.

［12］Pillie J W，Ren J，O'Regan M H.Transporter reversal as a mechanism of glutamate release from the ischemic rat cerebral cortex:studies with DL－threo－beta－benzyloxyaspartate［J］.Brain Research，2000，868(1):105－112.

［13］Reddy P H，Beal M F.Are mitochondria critical in the pathogenesis of Alzheimer’s disease［J］.Brain Res Rev，2005，49(3):618－632.

［14］陳元新，林祥通，趙剛.大鼠腦缺血再灌注半暗帶B淀粉樣前蛋白mRNA表達與梗死體積的關(guān)系［J］.中國神經(jīng)科學雜志，2005，18(1):454－457.

［15］Pluta R，Januszewski S，Jab?oński M，et al.Factors in creepy delayed neuronal death in hippocampus following brain ischemia－reperfusion injury with long－term survival［J］.Acta Neurochir Suppl，2010，106(2):37－41.

［16］Hiltunen M，M?kinen P，Per?niemi S，et al.Focal cerebral ischemia in rats alters APP processing and expression of Abeta peptide degrading enzymes in the thalamus［J］.Neurobiol Dis，2009，35(1):103－113.