閆韶飛 文朝陽 高爾靜 牛 靜 鄭少鵬 丁 衛(wèi)*

(1.首都醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生物化學與分子生物學系，北京 100069;2.首都醫(yī)科大學醫(yī)學影像學分析測試中心，北京 100069)

腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)是基因治療中發(fā)展比較成熟的病毒載體之一，其中Ⅱ型腺相關(guān)病毒(AAV2)的應(yīng)用最為廣泛［1］。近年來的研究［2-4］結(jié)果提示，腺相關(guān)病毒在宿主細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運過程是其轉(zhuǎn)導激活并表達所攜帶外源基因時所需要的主要限速步驟之一。然而病毒在被細胞內(nèi)吞后的分選(sorting)步驟通常是非常復(fù)雜的多階段動態(tài)過程，并且常常具有很強的多態(tài)性。盡管在過去基于對細小病毒種屬的研究中，曾有其在晚期內(nèi)體分選的電鏡證據(jù)等提示性結(jié)果，但對于腺相關(guān)病毒這一家族成員在特定細胞系中內(nèi)體分選的情況，特別是應(yīng)用現(xiàn)代熒光標記和成像技術(shù)的直接研究相對較少，且部分報道［3，5-7］存在分歧。

當前在針對細胞囊泡運輸及其分選機制的主流研究中，RAB蛋白是公認的特異性最好的囊泡類型標志物。其中RAB7在成熟的晚期內(nèi)體(late endosome，LE)表面有比較廣泛的特異性分布，不僅參與了晚期內(nèi)體的正常生物學功能，同時也可以用作晚期內(nèi)體的示蹤和分離標志物［8］。RAB11是細胞內(nèi)循環(huán)內(nèi)體 (recycling endosome，RE)的標志物，與RAB7陽性的晚期內(nèi)體有著截然不同的形態(tài)和分布，2者較少存在交叉［9］。IB3細胞是取源于男性囊性肺纖維化患者的支氣管上皮組織，經(jīng)SV40腺病毒感染永生化后所得到的細胞系。IB3細胞對AAV2有較好的易感性，比較容易進行質(zhì)粒的瞬時轉(zhuǎn)染實驗［10］。正常培養(yǎng)條件下，細胞生長比較鋪展，比較適于進行高分辨力的顯微圖像分析。此外，IB3細胞的內(nèi)體豐富，細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運途徑活躍，在病毒分離實驗的回收效率較好。因此，本研究中采用了該細胞系為研究對象，利用形態(tài)學和細胞生物學的不同方法針對AAV的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運進行了相關(guān)的實驗。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

IB3細胞從美國模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC)獲得，用含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的 DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。腺相關(guān)病毒AV2.luc由本實驗室依照經(jīng)典的三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)通過轉(zhuǎn)染293T宿主細胞制備，經(jīng)氯化銫梯度離心進行純化，透析后由qPCR方法確定病毒滴度后分裝備用。PCR引物和探針購自美國IDT公司。Rab7和Rab11的GFP和HA標簽質(zhì)粒由美國愛荷華大學Dr.Engelhardt實驗室饋贈。HA單克隆抗體購自羅氏公司。FITC-Dextran購于Invitrogen公司。60%碘克沙醇儲存原液和Dynabeads分別為Invitrogen和挪威Nycomed公司產(chǎn)品。RAB7的小干擾RNA(sc29460)由美國Santa Cruz公司提供。其他化學試劑如未經(jīng)特殊說明均購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 腺相關(guān)病毒的熒光標記與共聚焦顯微成像

將總量為1×1 011顆粒的純化腺相關(guān)病毒AV2.luc解凍后重懸于0.5 mL PBS，并與新鮮配制的等體積含有適量AF568熒光染料的100 mmol/L NaHCO3(pH 9.3)混合，室溫孵育30 min，其間每10 min充分混勻1次，以10 mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)終止反應(yīng)。標記后的病毒通過分子篩柱層析去除過量染料，用超濾離心管濃縮后，通過qPCR進行滴度測定，分裝備用。

IB3細胞被接種到0.13 mm蓋玻片上，待生長至50%匯合，用Lipofectamine 2000將GFP-Rab7或GFPRab11質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至IB3細胞，24 h后將細胞進行10 min 4℃預(yù)冷，與約10 000病毒顆粒/細胞的AF568-AV2.luc在4℃下孵育20 min，隨后移至37℃ 培養(yǎng)2 h。感染后，細胞用冰預(yù)冷的PBS漂洗4次，經(jīng)4%多聚甲醛固定，以DAPI復(fù)染細胞核，使用Leica共聚焦顯微鏡進行觀察和成像。

1.3 密度梯度離心和免疫親和沉淀法分離含有感染后病毒顆粒的細胞內(nèi)體

將IB3細胞接種于100 mm的培養(yǎng)皿中，在37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)至細胞70%匯合。用經(jīng)典的磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法導入HA-RAB7或用于其他對照組實驗的過表達質(zhì)粒，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后。在4℃下將感染復(fù)數(shù)m.o.i(multiplicity of infection)為10 000 病毒/細胞的AV2.luc病毒與細胞孵育30 min后，轉(zhuǎn)入37℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h。感染后的細胞短暫胰酶消化收集后，用冰預(yù)冷的勻漿緩沖液(250 mmol/L蔗糖，10 mmol/L三乙醇胺，EDTA和PMSF各1 mmol/L)重懸，在冰上研磨。通過相差顯微鏡觀察去核的細胞比例達60%～80%時，800 g低速條件下離心10 min，得到PNS(perinuclear supernatant)上清。將1.5 mL的PNS混合碘克沙醇調(diào)整到32%的終濃度并加載到SW55Ti離心管底部，依次覆蓋24%的碘克沙醇1.5 mL和20%碘克沙醇1.5 mL，最后充滿勻漿緩沖液。經(jīng)過4℃，124 000 g離心1 h，從離心管頂部依次收集11個組分，每份收集物約為0.5 mL。將第2～4組分合并，與預(yù)先包被 HA抗體和經(jīng)過1%BSA封閉的Dynabeads磁珠混合，室溫震蕩孵育4～6 h，以磁鐵吸附固定磁珠，收集上清并標記為unbound;磁珠經(jīng)PBS漂洗2次后，用1.5 mol/L NaCl洗脫，標記為 bound，其中的回收病毒經(jīng)Taqman定量PCR測定滴度后，作相應(yīng)的稀釋，可用于二次感染實驗。

1.4 Taqman定量PCR方法進行腺相關(guān)病毒的滴度測定

含有AV2.luc的細胞內(nèi)體用不含核酸酶的蛋白激酶K經(jīng)55℃消化過夜，然后煮沸10 min終止反應(yīng)。TaqMan qPCR的引物和探針由Primer Express V1.5軟件設(shè)計，針對熒光素酶編碼區(qū)引物和探針序列分別為 P1:5'-TTTTTG AAGCGA AGGTTG TGG-3'，P2:5'-CACACA CAGTTC GCCTCT TTG-3';probe:5'-ATCTGG ATACCG GGAAAA CGCTGG GCGTTA AT-3'，其中5'和3'末端分別帶有6羧基熒光素(FAM)和6羧基四甲基熒光紅(TAMRA)標記。體積為25 μL的PCR反應(yīng)體系組成為:待測樣本或AV2.luc標準稀釋樣品 10 μL;引物和探針共 2.5 μL，終濃度分別為500和100 nmol/L;通用型PCR Master Mix(ABI公司)12.5 μL。定量檢測由 ABI-7700設(shè)備完成，PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性10 min后開始雙步法擴增(95℃ 15 s、60℃ 60 s)，共40個循環(huán)。

1.5 熒光素酶活性測定

IB3細胞以40%～50%的匯合密度接種于48孔板中，在含10%FBS的DMEM中培養(yǎng)24 h后，回收的AV2.luc以500病毒顆粒/細胞的劑量感染48 h后，用裂解液溶解，根據(jù)Promega公司試劑盒推薦實驗條件，使用Lumat 9500B儀器進行熒光酶的活性測定。

接種于24孔培養(yǎng)板的IB3細胞分別進行不同的質(zhì)?；蛐NA轉(zhuǎn)染24 h后，或經(jīng)過10 μmol/L BFA處理12 h后，以1 000病毒顆粒/細胞的AV2.luc感染細胞48 h后，依照同樣的方法，測定熒光素酶的活性。

2 結(jié)果

本研究首先利用熒光標記技術(shù)通過形態(tài)學分析發(fā)現(xiàn)了RAB7與AAV2在IB3細胞中顯著的共定位現(xiàn)象，繼而建立了用于回收感染后經(jīng)過細胞轉(zhuǎn)運進入RAB7囊泡中AAV2的分離和純化方法。通過將回收的病毒用于對細胞的二次感染實驗，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)導IB3細胞的活性發(fā)生了改變。最后，通過RNA干擾和化學藥物處理的手段改變RAB7介導的內(nèi)體分選途徑，驗證了RAB7所參與的晚期內(nèi)體成熟過程在腺相關(guān)病毒的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運和轉(zhuǎn)導激活步驟中發(fā)揮了重要的作用。上述結(jié)果，分別由如下圖1至圖4順序顯示。

圖1 AlexaFluor568標記的Ⅱ型腺相關(guān)病毒與細胞內(nèi)GFP-RAB蛋白在IB3細胞內(nèi)的共定位分析Fig.1 The intracellular localization of AlexFluor568-labeled adeno-associated virus in IB3 cells transfected with GFP-RAB fusion proteins

3 討論

病毒的熒光標記技術(shù)為以細胞影像學手段研究感染動力學提供了極大的方便，并且在腺相關(guān)病毒的研究中有過一些嘗試［11-12］。隨著激光共聚焦技術(shù)的發(fā)展，為進一步認識AAV在細胞內(nèi)亞細胞結(jié)構(gòu)中的分布和定位提供了可能。

圖4 對晚期內(nèi)體成熟過程的干擾降低Ⅱ型腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)導在IB3細胞中的轉(zhuǎn)導活性Fig.4 The interference of the maturation of the late endosome impaired the transduction activation of adeno-associated virus in IB3 cells

RAB家族成員是一類與Ras具有較高同源性的小相對分子質(zhì)量GTP酶，其種類繁多且在進化中有較高的保守性，目前在哺乳動物細胞中已發(fā)現(xiàn)多達70余種。RAB在細胞的內(nèi)吞、分泌、囊泡的成熟、融合和運輸?shù)纫幌盗屑毎麅?nèi)轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮著極為重要的作用，不同類型的囊泡表面通常會攜帶不同種類的RAB蛋白及其效應(yīng)分子，其相對的特異性分布被形象地稱為是細胞內(nèi)膜和囊泡系統(tǒng)的“郵政編碼(zip code)”［13-14］。各種 RAB在 N端的 GFP融合蛋白均基本保留了野生型RAB蛋白的正常活性，因而成為細胞生物學研究中的重要工具。針對RAB蛋白在結(jié)合GTP的模序部分而設(shè)計的突變體，使其失去水解GTP成為GDP的酶學活性，可以產(chǎn)生相應(yīng)RAB的顯性抑制變異體形式(dominant-negative variant)，其在細胞內(nèi)的過表達可以用來對相應(yīng)野生型RAB的正常功能進行逆向分析和驗證。此外，針對不同RAB的RNA干擾技術(shù)和一些影響細胞轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的藥物處理也是研究RAB功能的有效手段［3］。如:布雷菲德菌素(Brefeldin A，BFA)是一種真菌代謝產(chǎn)物，常被用作細胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運的抑制劑。BFA能夠可逆性地阻斷蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的運送，可以通過抑制一些GTP水解酶的GTP交換因子，從而影響細胞內(nèi)膜形成轉(zhuǎn)運囊泡(transport vesicles)。許多實驗［6］證據(jù)表明，經(jīng)過BFA處理后的細胞其內(nèi)體的成熟過程受到嚴重的干擾和影響較高相對分子質(zhì)量的葡聚糖Dextran在晚期內(nèi)體中可以有較強的富集現(xiàn)象，而FITC等熒光標記的Dextran可以作為“負荷物(cargo)”用于晚期內(nèi)體的加載(loading)或示蹤(tracing)實驗。本研究首先通過共聚焦顯微成像分析確認了AAV2在RAB7陽性的囊泡中有比較廣泛的分布，這與以其他細胞模型的部分早期報道［5-6］一致。并且本研究的結(jié)果提示，在IB3細胞中RAB7與標記病毒的共定位程度大大高于RAB11的情況，RAB7的過表達或顯性抑制均可能對AAV在感染后細胞內(nèi)的分布產(chǎn)生較大的影響。

包括腺相關(guān)病毒在內(nèi)的細小病毒家族成員在轉(zhuǎn)導活化的過程中很大程度上依賴于宿主細胞的受體依賴性內(nèi)吞途徑，盡管一系列的研究證據(jù)，如溫度、ATP、Dynamin和細胞骨架系統(tǒng)對病毒轉(zhuǎn)導的影響等［15-16］，以及包括免疫電鏡圖像數(shù)據(jù)，均比較支持類似的推論，但是利用生化分離技術(shù)回收感染后的病毒顆粒并且重新評價其感染活力的嘗試由于具有相當?shù)奶魬?zhàn)性而比較缺乏［17］。本研究首先利用了具有高度特異性和親和力的HA生化標簽，通過轉(zhuǎn)染HA-RAB過表達功能性融合蛋白，優(yōu)化了針對晚期內(nèi)體的病毒回收和分離技術(shù)，獲得了比較穩(wěn)定可靠的結(jié)果。隨后將回收的病毒用于2次感染實驗，發(fā)現(xiàn)在RAB7陽性晚期內(nèi)體中的AAV具有較高的感染活力。在進一步的驗證性實驗中發(fā)現(xiàn)，干擾RAB7參與的晚期內(nèi)體成熟過程，可以導致AAV2對IB3細胞轉(zhuǎn)導活性的降低。

雖然AAV能夠以完整的病毒顆粒形式進入宿主細胞核中，但也有研究［2-3，18］表明病毒在胞質(zhì)中的結(jié)構(gòu)改變、衣殼蛋白化學修飾、從內(nèi)體中的逃逸，甚至徹底的脫衣殼過程，同樣對病毒的激活至關(guān)重要。也有報道［19-20］認為，晚期內(nèi)體的弱酸性環(huán)境，有利于暴露AAV衣殼蛋白中的保守性磷脂酶A活性片段，從而幫助病毒脫離內(nèi)體的包被，加速細胞核轉(zhuǎn)運和脫衣殼過程。本研究的結(jié)果大體與類似的假說推論相符合，但是回收病毒在2次感染中的活性增加程度相對有限，表明晚期內(nèi)體所造成的病毒性質(zhì)改變未必非常顯著，并且有可能存在較大的異質(zhì)性。此外，從本研究的結(jié)果中并不能推測回收病毒所具有的不同轉(zhuǎn)導活性究竟是由于衣殼蛋白的器質(zhì)性改變，還是由于回收病毒中復(fù)合了細胞膜、受體分子或其他有助于病毒感染的成分。盡管如此，本研究對于分別從RAB7和RAB11囊泡分離的AAV在感染活性上存在差異的結(jié)果，為此前類似的發(fā)現(xiàn)和報道提供了更為直接的證據(jù)［5-7］。只是2者在程度上的差別可能與感染的滴度或細胞類型的不同有關(guān)［5］。

關(guān)注AAV在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運過程及其調(diào)節(jié)因素不僅可以加深和豐富對基因工程病毒載體的認識，推動其感染動力學的基礎(chǔ)研究，為載體的進一步改良提供線索［21］，并且很可能在AAV的臨床應(yīng)用中有著更加現(xiàn)實的意義，成為優(yōu)化病毒使用適應(yīng)證和方案的考慮因素之一。

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