劉 揚(yáng) 趙詠梅 張海燕 李衛(wèi)紅 岳 云*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)北京朝陽(yáng)醫(yī)院麻醉科，北京 100020;2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，教育部神經(jīng)變性病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100053;3.首都醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室，北京 100069)

核相關(guān)受體因子(nuclear receptor related factor1，Nurr1)屬于類固醇/甲狀腺激素核受體超家族成員，是未知配體的孤兒核受體，作為核轉(zhuǎn)錄因子，與神經(jīng)前體細(xì)胞向多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元方向分化、成熟密切相關(guān)［1］。在nurr1高表達(dá)的中腦黑質(zhì)致密部，DA能神經(jīng)元的退行性變性和丟失是帕金森病(Parkinson disease，PD)的主要病理特征［2］，但這種選擇性損傷DA能神經(jīng)元的病因和發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［3］發(fā)現(xiàn)，敲除nurr1基因的小鼠只在黑質(zhì)紋狀體和腹側(cè)被蓋處不能形成DA能神經(jīng)元，并伴隨DA濃度明顯下降，這與PD的病理特征極其相似;對(duì)PD患者的調(diào)查研究［4］證實(shí)了家族性PD患者的nurr1基因存在2個(gè)異體突變位點(diǎn)。由此推論，nurr1基因的功能可能與PD患者中腦DA能神經(jīng)元損傷易感性相關(guān)，具體機(jī)制尚不明確。

PD患者的中腦黑質(zhì)致密部DA能神經(jīng)元病理變化可能存在一條共同的通路，即細(xì)胞凋亡。Hartmann A等［5］在PD死亡患者中發(fā)現(xiàn)中腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的凋亡特征性改變，并檢測(cè)到細(xì)胞缺失與凋亡起始因子Caspase-3的表達(dá)密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡可能是引起PD患者黑質(zhì)中DA能神經(jīng)元死亡和丟失的直接原因。

本研究小組已經(jīng)證明過(guò)表達(dá)外源性nurr1基因的SK-N-SH/Nurr1細(xì)胞對(duì)6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)損傷敏感性增強(qiáng)［6］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察6-OHDA作用于Nurr1+/－細(xì)胞株后，比較超微結(jié)構(gòu)以及凋亡因子Caspase-3表達(dá)的變化，研究SK-NSH/Nurr1細(xì)胞損傷是否通過(guò)細(xì)胞凋亡途徑，以明確Nurr1基因在SK-N-SH/Nurr1細(xì)胞對(duì)6-OHDA損傷易感性中的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1)細(xì)胞株:人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SK-N-SH細(xì)胞由首都醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物教研室提供，SK-N-SH/Nurr1細(xì)胞模型由本研究小組將表達(dá)nurr1基因的質(zhì)粒載體pBK-RSV-Nurr1轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細(xì)胞后成功建立［7］。簡(jiǎn)言之，用脂質(zhì)體基因轉(zhuǎn)染法將帶有nurr1基因的載體pBK-RSV-Nurr1轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細(xì)胞，經(jīng)500 mg/L G418篩選。為排除質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞可能存在的影響，本研究還設(shè)立了過(guò)表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)的 SK-N-SH/EGFP細(xì)胞平行對(duì)照組。

2)細(xì)胞培養(yǎng)試劑:DMEM(Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞鑒定試劑:Nurr1抗體(Santa Cruz公司);SP免疫組化試劑盒(Zymed Laboratories公司);TRIzol(Gibco公司);RT-PCR第一鏈合成試劑盒(Invitrogen公司);PCR PreMix反應(yīng)體系(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)。藥物實(shí)驗(yàn)試劑:6-OHDA(Sigma公司);Annxin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒(北京寶賽生物技術(shù)有限公司)。

3)儀器:流式細(xì)胞儀(FACSCalibur，BD，USA);透射電鏡(Philips，EM208S，Holand)。

1.2 方法

1)細(xì)胞培養(yǎng):3株細(xì)胞用含10%滅活胎牛血清、青霉素1×105U/L、鏈霉素0.1 g/L的DMEM完全培養(yǎng)基，置CO2培養(yǎng)箱，37℃、3.5%CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞每周傳代2次，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要將細(xì)胞按合適密度接種于培養(yǎng)瓶中。

2)免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞Nurr1表達(dá):免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色一抗為Nurr1抗體(1∶1 000)，二抗為熒光素CY3標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體(1∶200)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色按SP試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用DAB顯色。

3)RT-PCR鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞Nurr1 mRNA表達(dá):用TRIzol提取總RNA反轉(zhuǎn)錄后行PCR。Nurr1及β-actin引物系根據(jù)GenBank中相應(yīng)基因序列自行設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程公司合成。引物序列如下:NURR1(299 bp):5'-agtacctttatggacaactacagca-3'和5'-cgtagtggccacgtagttctggt-3';β-actin(540 bp):5'-gtggggcgccccaggcacca-3'和5'-cttccttaatgtcacgcacgatttc-3'。PCR反應(yīng)條件為:94℃變性5 min后，按94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，擴(kuò)增28個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠中電泳后在紫外燈下觀察、照相。

4)流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)測(cè)定細(xì)胞早期凋亡比例:向?qū)?shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分別加入50、75、100 μmol/L 6-OHDA，對(duì)照組更換新鮮培養(yǎng)基。分別在6、12 h后結(jié)束孵育，收集細(xì)胞1×106，1 000 r/min離心5 min，PBS 洗滌，加入 Binding Buffer 150 μL 和Annexin V-FITC 10 μL，室溫，避光染色 30 min。再加入PI(50 mg/L)5 μL，避光反應(yīng)5 min后，立即進(jìn)行FCM(激發(fā)/發(fā)射488 nm/530 nm和600 nm)檢測(cè)早期凋亡。數(shù)據(jù)采用Cell Quest軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)檢測(cè)4次。

5)透射電鏡(transmission electron microscopy，TEM)觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu):向?qū)?shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞加入75 μmol/L 6-OHDA，對(duì)照組更換新鮮培養(yǎng)基。孵育12 h后，收集細(xì)胞，洗滌，棄上清，放入預(yù)冷的2%多聚甲醛-2.5%戊二醛前固定液(pH 7.4)，4℃固定2 h。二甲砷酸鈉緩沖液浸洗，1%鋨酸(OSO4)4℃后固定2 h，梯度乙醇脫水，環(huán)氧丙烷置換，環(huán)氧樹(shù)脂Epon812包埋。1 μm厚切片用天青美藍(lán)染色作定位，超薄切片經(jīng)醋酸雙氧鈾/枸櫞酸鉛雙重染色，TEM觀察。

6)Western blotting檢測(cè)Caspase-3活性前體蛋白表達(dá):細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h。向?qū)?shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞加入含75 μmol/L 6-OHDA的完全培養(yǎng)基，對(duì)照組更換新鮮培養(yǎng)基，分別在培養(yǎng)6、12 h后結(jié)束孵育，收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，PBS洗滌。向細(xì)胞沉淀中加入細(xì)胞裂解液160 μL，超聲破碎，用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取30 μg樣品蛋白，煮沸變性，通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(10%分離膠，4%聚集膠)分離蛋白質(zhì)。取出凝膠，400 mA，冰浴中行電轉(zhuǎn)移3 h。取出硝酸纖維素膜用TBS清洗2次，然后置于封閉液(含10%脫脂奶粉的TTBS)中，室溫下封閉1 h。加入一抗，鼠抗人Caspase-3單克隆抗體(1∶500，Santa Cruz)，4 ℃ 過(guò)夜，洗膜 3 次，每次 10 min。加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1∶4 000)，室溫下孵育2 h，洗膜3次，每次10 min。按發(fā)光試劑盒(PIERCE公司)說(shuō)明書(shū)顯影，用Gel-Doc凝膠成像系統(tǒng)掃描X線，對(duì)條帶密度進(jìn)行半定量分析，分別計(jì)算出2株細(xì)胞經(jīng)6-OHDA作用不同時(shí)間后Caspase-3活性前體蛋白條帶與各自正常細(xì)胞Caspase-3活性前體蛋白條帶的密度比值，得到各實(shí)驗(yàn)組Caspase-3活性前體蛋白表達(dá)的百分比。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后，以6-OHDA作用時(shí)間為橫坐標(biāo)，Caspase-3活性前體蛋白表達(dá)百分比為縱坐標(biāo)繪制統(tǒng)計(jì)分析圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Sigma plot 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。應(yīng)用Two Way ANOVA析因方差法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

SK-N-SH、SK-N-SH/Nurr1和 SK-N-SH/EGFP 3株細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差異，均呈對(duì)數(shù)方式增生，SK-NSH/Nurr1細(xì)胞增生率最低，SK-N-SH和SK-N-SH/EGFP細(xì)胞增生率較為接近［6］。

2.2 Nurr1基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的鑒定

免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示SK-N-SH和SK-NSH/EGFP細(xì)胞Nurr1抗體染色陰性(圖1A，1B)，而SK-N-SH/Nurr1細(xì)胞傳代5次Nurr1抗體染色仍為陽(yáng)性，其陽(yáng)性細(xì)胞胞核深染，胞質(zhì)及突起淡染(圖1C)。熒光顯微鏡顯示EGFP在SK-N-SH/EGFP細(xì)胞高表達(dá)(1D)。以上結(jié)果說(shuō)明已成功建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)外源性Nurr1基因的SK-N-SH 細(xì)胞模型SK-N-SH/Nurr1，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)nurr1檢測(cè)無(wú)影響。

RT-PCR結(jié)果顯示未轉(zhuǎn)染Nurr1基因的SK-N-SH細(xì)胞檢測(cè)不到Nurr1 mRNA(圖2A)，而轉(zhuǎn)染Nurr1基因的SK-N-SH/Nurr1細(xì)胞檢測(cè)到高水平的NURRr1 mRNA表達(dá)(圖2B)。

2.3 過(guò)表達(dá)nurr1基因促進(jìn)6-OHDA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡比例增加

細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)后不久，磷脂酰絲氨酸(phosphatiylserine，PS)從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)移到外側(cè)，可被熒光素(fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白Annexin V特異性地結(jié)合［8］。由于PS外露發(fā)生早于DNA斷裂，聯(lián)合PI法進(jìn)行FCM檢測(cè)，可區(qū)分、定量分析4個(gè)細(xì)胞亞群，包括Annexin V－/PI－的正常細(xì)胞亞群(左下象限);Annexin V+/PI－的早期凋亡細(xì)胞亞群(右下象限);Annexin V+/PI+的壞死細(xì)胞亞群(右上象限)，其中包括凋亡晚期和壞死細(xì)胞，以及Annexin V－/PI+的受損細(xì)胞亞群(左上象限)。

FCM檢測(cè)結(jié)果顯示，正常SK-N-SH和SK-N-SH/Nurr1細(xì)胞凋亡或壞死細(xì)胞亞群比例均較低(圖3-1A，B)。較小劑量 6-OHDA(50 μmol/L)作用 12 h，2株細(xì)胞凋亡和壞死細(xì)胞亞群比例均沒(méi)有明顯變化(圖3-1C，D)。當(dāng)6-OHDA 濃度升至75 μmol/L作用12 h后，SK-N-SH細(xì)胞正常亞群比例仍然較高，凋亡細(xì)胞亞群比例在 6-OHDA處理后為3.1% ±0.5%(圖3-1A，E)，而SK-N-SH/Nurr1細(xì)胞凋亡亞群比例由6-OHDA處理前的1.1% ±0.6%升至10.1% ±1.1%(圖3-1B，F(xiàn))，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，2 組細(xì)胞凋亡差異顯著(P=0.000)。大劑量 6-OHDA(100 μmol/L)作用6 h后，兩株細(xì)胞凋亡亞群比例比起6-OHDA處理前沒(méi)有增加(圖3-2A，B)，而2株細(xì)胞壞死亞群比例均明顯上升(圖3-2C，D);100 μmol/L 6-OHDA 作用12 h后，SK-N-SH細(xì)胞壞死亞群升至18.5% ±1.3%，SK-N-SH/Nurr1細(xì)胞壞死亞群升至27.4% ±1.7%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，2株細(xì)胞壞死亞群比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.080)，但均較6-OHDA處理前上升顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，但2株細(xì)胞凋亡亞群比例仍然很低，分別為 1.4% ±0.03%和2.2% ±0.17%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.060)(圖 3-2E，F(xiàn))。

圖1 免疫組化染色顯示Nurr1抗體在SK-N-SH、SK-N-SH/Nurr1和SK-N-SH/EGFP細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 Immunocytochemical staining results of SK-N-SH，SK-N-SH/Nurr1 and SK-N-SH/EGFP cells with Nurr1 antibody(original magnification 400×)

圖2 RT-PCR法檢測(cè)Nurr1 mRNA在SK-N-SH和SK-N-SH/Nurr1細(xì)胞中的表達(dá)Fig.2 Nurr1 mRNA in SK-N-SH and SK-N-SH/Nurr1 cells was detected by RT-PCR analysis

2.4 過(guò)表達(dá)nurr1基因促進(jìn)6-OHDA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡形態(tài)改變

TEM觀察，正常SK-N-SH和SK-N-SH/Nurr1細(xì)胞微絨毛豐富，胞膜完整，線粒體較少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面有多聚核糖體附著，有核異型現(xiàn)象(圖4-1A，B，圖4-2A，B)。75 μmol/L 6-OHDA 作用12 h，SK-N-SH 細(xì)胞以壞死為主，表現(xiàn)為細(xì)胞體腫脹，胞膜崩解，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、脫顆粒，線粒體嵴斷裂、消失或呈空泡化改變，胞質(zhì)及胞核內(nèi)電子密度普遍降低，核內(nèi)染色質(zhì)溶解，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)髓樣小體(圖4-1C，D)，而SK-N-SH/Nurr1細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞膜完整，胞質(zhì)減少，線粒體基本正常，核內(nèi)染色質(zhì)凝集成塊狀并有邊集現(xiàn)象，電子密度明顯增加。個(gè)別處于凋亡晚期的細(xì)胞核可見(jiàn)染色質(zhì)進(jìn)一步凝聚，聚集成染色質(zhì)小塊或呈新月形(圖4-2C，D)。

2.5 6-OHDA誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞Caspase-3活性前體蛋白激活

Western blotting印跡結(jié)果顯示，正常的SK-N-SH和SK-N-SH/Nurr1細(xì)胞，在泳道上的32 000處均出現(xiàn)了特異蛋白條帶，肉眼觀察條帶的面積和著色無(wú)明顯差別。75 μmol/L 6-OHDA 分別作用6、12 h，SK-N-SH細(xì)胞各實(shí)驗(yàn)組在泳道上的32 000處的條帶面積以及著色變化不明顯，說(shuō)明Caspase-3活性前體蛋白表達(dá)基本不變。而 SK-N-SH/Nurr1細(xì)胞在75 μmol/L 6-OHDA分別作用6、12 h后，各實(shí)驗(yàn)組泳道上的32 000處的條帶著色隨6-OHDA作用時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸減弱(圖5 A，B)，說(shuō)明Caspase-3活性前體蛋白表達(dá)隨6-OHDA作用時(shí)間延長(zhǎng)而明顯下降。用Gel Doc凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行光密度值分析，并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，顯示75 μmol/L 6-OHDA 作用 6、12 h，SK-N-SH/Nurr1 細(xì)胞Caspase-3活性前體蛋白表達(dá)顯著低于SK-N-SH細(xì)胞(P=0.010)(圖6)。

圖4-1 75 μmol/L 6-OHDA作用12 h，經(jīng)透射電鏡觀察SK-N-SH細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Fig.4-1 The ultrastructural changes of SK-N-SH cells were observed by TEM after treatment with 75 μmol/L 6-OHDA for 12 h

3 討論

本研究通過(guò)比較人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SK-NSH細(xì)胞和過(guò)表達(dá)外源性 nurr1基因的SK-N-SH/Nurr1細(xì)胞對(duì)神經(jīng)毒素6-OHDA損傷的不同反應(yīng)，研究過(guò)表達(dá)中腦特異性轉(zhuǎn)錄因子nurr1基因在6-OHDA選擇性誘導(dǎo)DA能神經(jīng)元凋亡中的作用。經(jīng)6-OHDA作用，2株細(xì)胞表現(xiàn)出了不同的病理?yè)p傷特征，并且具有毒素劑量、作用時(shí)間依賴性:細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)以及AnnexinV/PI雙染聯(lián)合FCM檢測(cè)均顯示，75 μmol/L 6-OHDA作用12 h，SK-N-SH/Nurr1細(xì)胞凋亡比例顯著上升，而SK-N-SH細(xì)胞主要表現(xiàn)為細(xì)胞毒性壞死;大劑量6-OHDA(100 μmol/L)作用不同時(shí)間，SK-N-SH和SK-N-SH/Nurr1細(xì)胞均表現(xiàn)為壞死。可見(jiàn)，6-OHDA誘發(fā)SK-N-SH和SK-N-SH/Nurr1細(xì)胞死亡存在細(xì)胞凋亡和壞死兩條不同途徑，在75 μmol/L 6-OHDA作用下，nurr1基因主要激活SK-N-SH/Nurr1細(xì)胞凋亡通路，說(shuō)明6-OHDA的致凋亡作用與細(xì)胞種類和劑量相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)［9］顯示，6-OHDA能誘導(dǎo)中腦 DA能神經(jīng)元、兒茶酚胺細(xì)胞系PC12細(xì)胞及中腦源性DA能細(xì)胞系MN9D等細(xì)胞凋亡。Walkinshaw G等［10］最早報(bào)道低濃度的6-OHDA(≤100 μmol/L)能誘導(dǎo)PC12出現(xiàn)具有明顯生化和形態(tài)特征的凋亡，但高濃度的6-OHDA主要誘導(dǎo)細(xì)胞毒性損傷，與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。

圖6 75 μmol/L 6-OHDA 分別作用6、12h，SK-N-SH 和SK-N-SH/Nurr1細(xì)胞Caspase-3活性前體蛋白表達(dá)的變化Fig.6 Comparison of pro-Caspase-3 in SK-N-SH and SK-N-SH/Nurr1 cells treated with 75 μmol/L 6-OHDA for 6、12 h

在體外，過(guò)表達(dá)nurr1基因可促進(jìn)前體細(xì)胞向DA能神經(jīng)元分化，如在過(guò)表達(dá)nurr1的成年海馬前體細(xì)胞，nurr1可直接與酪氨酸羥化酶 (tyrosine hydroxylase，TH)基因的啟動(dòng)子結(jié)合，在不引起神經(jīng)元分化的情況下激活th轉(zhuǎn)錄［11］;若將過(guò)表達(dá)nurr1的C17.2細(xì)胞與腹側(cè)中腦來(lái)源的Ⅰ型星型膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，則可誘導(dǎo)大量的 th陽(yáng)性神經(jīng)元產(chǎn)生［12］;我們也已經(jīng)報(bào)道［7］，過(guò)表達(dá)nurr1基因的 SK-N-SH/Nurr1細(xì)胞能表達(dá)成熟神經(jīng)元的特異性標(biāo)識(shí)物-微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associated protein 2，MAP-2)，證明外源性nurr1基因過(guò)表達(dá)可促進(jìn)SK-N-SH細(xì)胞向成熟神經(jīng)元方向分化。以上研究表明nurr1表達(dá)與DA能神經(jīng)元的表型關(guān)系密切，經(jīng)6-OHDA作用后，DA能神經(jīng)元死亡形式可能與nurr1基因存在某些關(guān)聯(lián)。

Nurr1及其相關(guān)基因nurr1、nor-1共同組成核受體超家族中的NURR77亞家族，該亞家族成員由即早基因編碼［13］，各種刺激如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、缺血等都能引起這些基因快速短暫的表達(dá)上調(diào)［14］，參與細(xì)胞生存、增生以及凋亡過(guò)程。nurr1對(duì)凋亡過(guò)程的調(diào)節(jié)還不甚明了，但是nur77調(diào)節(jié)T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞凋亡通路研究較為深入［15-17］。nur77可以上調(diào)促凋亡基因如Fas配體、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)［18-20］。信號(hào)傳導(dǎo)因子JNK的激活以及Akt的抑制可促使nur77由細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)［21］，與線粒體Bcl-2組成凋亡前體復(fù)合物刺激凋亡反應(yīng)［22-23］。此外，PKC的活化可導(dǎo)致nur77表達(dá)上調(diào)，對(duì)T細(xì)胞受體信號(hào)誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞凋亡起到重要作用［24］。

研究［25］發(fā)現(xiàn)，在PD病人和動(dòng)物模型的中腦黑質(zhì)致密部，Caspase-3，作為神經(jīng)元凋亡的重要調(diào)控因子，其前體蛋白被激活的DA能神經(jīng)元顯著增加。存在急慢性神經(jīng)退行性疾病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其病理改變檢測(cè)到Caspase-3的激活，尤其在使用6-OHDA誘發(fā)PD后，Caspase-3前體蛋白激活后誘發(fā)凋亡過(guò)程。

由此，我們推測(cè)作為轉(zhuǎn)錄因子，nurr1基因可能具有調(diào)節(jié)不同信號(hào)傳導(dǎo)通路的作用，最終是否激活Caspase-3途徑，關(guān)系到細(xì)胞壞死、凋亡或免受損傷等不同結(jié)局，相關(guān)分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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