吳燕川 李堯華 謝勝男 李 昕 于 順 何士大

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100053;2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學(xué)研究室，北京 100053)

三磷酸腺苷(adenosine triphosphates，ATP)是生物機(jī)體的能量來(lái)源，在細(xì)胞代謝活動(dòng)中占有重要地位。腺苷酸指三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphates，ADP)和一磷酸腺苷(adenosinemonophosphate，AMP)的總稱。腺苷酸(ATP+ADP+AMP)濃度是描述細(xì)胞代謝的主要參數(shù)，在急性重復(fù)低氧小鼠腦組織中，測(cè)定腦組織中腺苷酸的含量具有重要意義。高效液相色譜-可變波長(zhǎng)檢測(cè)法(high performance liquid chromatogram-variable wavelength detector，HPLC-VWD)是目前測(cè)定嘌呤、嘧啶復(fù)合物含量變化的主要方法之一［1-7］。文獻(xiàn)［1，4-5］報(bào)道測(cè)定腺苷酸的方法在流動(dòng)相組成方面存在可優(yōu)化之處，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)改良的HPLC-VWD方法，測(cè)定急性重復(fù)低氧暴露小鼠腦組織中的三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、一磷酸腺苷的含量。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

Agilent1200高效液相色譜儀(安捷倫公司，美國(guó))，系統(tǒng)組成:G1322A脫氣機(jī)，G1311A四元泵，G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G1314B可變波長(zhǎng)檢測(cè)器，Agilent1200工作站。JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(上海新芝生物技術(shù)研究所)。

ATP、ADP、AMP標(biāo)準(zhǔn)品均為分析純(Sigma公司，美國(guó))，甲醇為色譜純(Fisher公司)，磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、高氯酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 色譜條件

SUPELCO Discovery○RC18反相色譜柱(15 mm×4.6 mm，5 μm)及填充材料相同的預(yù)柱(12.5 mm ×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相:磷酸鹽緩沖液(30 mmol/L，pH 5.85，緩沖對(duì)為 K2HPO4-KH2PO4，含 5% 甲醇)，先用 0.45 μm 濾膜過(guò)濾，再用 0.22 μm 的濾膜抽濾，現(xiàn)用現(xiàn)配。檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量20 μL;定量方法:采用外標(biāo)法定量。

1.3 動(dòng)物模型的制作

選用6～8周BALB/c近交系雄性小鼠，體質(zhì)量18～22 g，清潔級(jí)，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心〔SCXK-(軍)許可證號(hào):2002-001〕提供。將20只小鼠按照數(shù)字表法隨機(jī)分成4組，每組5只，分別進(jìn)行重復(fù)低氧暴露 0、1、3、5 次，命名為 H0、H1、H3、H5組。在18℃～20℃條件下將小鼠放入含有新鮮空氣的125 mL廣口瓶中，用橡皮塞塞緊并計(jì)時(shí)。隨著小鼠的呼吸，氧氣逐漸減少，當(dāng)小鼠第1次出現(xiàn)哮喘呼吸后，立即結(jié)束低氧處理，此為低氧1次(H1組)。將小鼠取出，待小鼠恢復(fù)翻正反射后(約需1～3 min)，將其放入一個(gè)新的廣口瓶中，塞緊橡皮塞。依此方法，給小鼠連續(xù)缺氧處理5次，記錄每次從密閉開(kāi)始到喘呼吸出現(xiàn)的時(shí)間。該時(shí)間稱為小鼠低氧耐受時(shí)間。

1.4 重復(fù)低氧暴露小鼠腦組織中磷酸腺苷的提取

當(dāng)小鼠達(dá)到缺氧耐受極限時(shí)，立即拿出，在冰臺(tái)上迅速斷頭取腦并稱質(zhì)量，按5 μL/mg的比例加入冰預(yù)冷的0.4 mol/L高氯酸，于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中粉碎、勻漿;4 ℃，10 000×g離心，10 min，2次;取上清液，用5 mol/L的KOH調(diào)pH值至6.0～6.5，取上清，用 0.22 μm 濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(One-way ANOVA)。組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性關(guān)系及檢測(cè)限

用超級(jí)純凈水將ATP、ADP、AMP的標(biāo)準(zhǔn)品分別配成1 g/L的儲(chǔ)備液，再用超級(jí)純凈水稀釋成10、20、40、60、80、100 mg/L 的濃度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)腺苷酸以其濃度為橫坐標(biāo)C，以其面積為縱坐標(biāo)A進(jìn)行線性回歸分析，得到腺苷酸回歸方程與相關(guān)系數(shù)分別為:① ATP:A=28.924C+14.144，γ =0.999 90;②ADP:A=31.504C － 12.608，γ =0.999 92;③ AMP:A=46.539C －5.255，γ =0.999 95。ATP、ADP、AMP標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖及腦組織中腺苷酸樣品色譜圖詳見(jiàn)圖1。倍信噪比為3，檢出限為1 μg。

圖1 ATP、ADP、AMP的標(biāo)準(zhǔn)品及組織樣品色譜圖Fig.1 The chromatogram of adenine nucleotides standard and tissue sample

2.2 精密度測(cè)定實(shí)驗(yàn)

將腺苷酸標(biāo)準(zhǔn)品混合液40 mg/L一天8 h內(nèi)不定時(shí)進(jìn)樣5次，進(jìn)行色譜分析，測(cè)得日內(nèi)精密度;配以相同濃度的 ATP、ADP、AMP，每天進(jìn)樣測(cè)定，共 5 d，測(cè)得日間精密度。詳見(jiàn)表1。

2.3 回收率實(shí)驗(yàn)

于已知濃度的腦組織中分別加入濃度為20、40及60 mg/L的腺苷酸標(biāo)準(zhǔn)品混合液，測(cè)定后扣除樣品中原有含量，得到ATP、ADP、AMP的平均回收率(n=5)。詳見(jiàn)表2。

表1 ATP、ADP和AMP日內(nèi)、日間精密度Tab.1 The precision of ATP、ADP and AMP (%)

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The results of recovery rate

2.4 各組實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

測(cè)定20只低氧暴露小鼠腦組織中ATP、ADP及AMP的含量，共4組，每組5只。詳見(jiàn)表3。

表3 低氧暴露小鼠腦組織中腺苷酸含量檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Concentration of adenosine phosphates in the mouse brain()

表3 低氧暴露小鼠腦組織中腺苷酸含量檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Concentration of adenosine phosphates in the mouse brain()

*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01 vs H0 group;ATP:adenosine triphosphate;ADP:adenosine diphosphate;AMP:adenosine monophosphate.

Index H0 H1 H3 H5 ATP 3.23 ±1.2 2.97 ±0.8 8.365 ±3.1＊＊ 5.235 ±3.2*ADP 15.07 ±3.7 20.1 ±7.1 24.42 ±6.0 17.51 ±7.0 AMP 45.61 ±10.7 52.38 ±11.0 45.27 ±5.8 46.59 ±11.5

其中H3及H5組與H0組ATP比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01，P ＜0.05，n=5)。

3 討論

流動(dòng)相的潔凈程度對(duì)HPLC實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行至關(guān)重要，不潔的流動(dòng)相會(huì)使系統(tǒng)壓力增加、基線噪音增大，產(chǎn)生漂移，甚至終止進(jìn)樣。本實(shí)驗(yàn)使用國(guó)產(chǎn)分析純磷酸鹽緩沖液做流動(dòng)相中的無(wú)機(jī)鹽成分，由于相對(duì)于進(jìn)口產(chǎn)品，國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭﹥r(jià)格很便宜但含雜質(zhì)比較多，因此在進(jìn)樣前對(duì)所配流動(dòng)相用0.45 μm濾膜過(guò)濾，再用0.22 μm的濾膜抽濾的雙重過(guò)濾方法，使整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中系統(tǒng)壓力一直很平穩(wěn)，確保了實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。有文獻(xiàn)［1，4，7］報(bào)道流動(dòng)相中使用了乙腈。乙腈是一種價(jià)格昂貴且毒性較大的試劑。本實(shí)驗(yàn)采用甲醇替代乙腈，既經(jīng)濟(jì)又能很好地分離3種腺苷酸。文獻(xiàn)［5］報(bào)道使用無(wú)有機(jī)溶劑的流動(dòng)相，雖然可以降低實(shí)驗(yàn)費(fèi)用，但本實(shí)驗(yàn)室的Supelco Discovery C18反相柱不是純水相柱，純水相的流動(dòng)相會(huì)降低柱性能，使柱子中固定相硅膠受損，對(duì)反相柱壽命影響很大。本實(shí)驗(yàn)比較過(guò)含5%和含10%甲醇的流動(dòng)相進(jìn)行分離分析，結(jié)果提示含5%的流動(dòng)相可使3種物質(zhì)在10 min內(nèi)就能很好地分離，可操作性強(qiáng)。

生物體產(chǎn)生的ATP是其各種生命活動(dòng)所需能量的直接來(lái)源，有氧情況下產(chǎn)生的ATP是其能量的主要來(lái)源。ATP去磷酸化轉(zhuǎn)化為ADP和AMP，從而釋放能量供生物體利用。低氧預(yù)適應(yīng)是一種細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，這種機(jī)制在短暫、亞致死性的重復(fù)性低氧刺激下可增強(qiáng)組織對(duì)繼發(fā)嚴(yán)重低氧的耐受程度［8］。動(dòng)物整體低氧耐受時(shí)間是衡量腦組織低氧耐受的一個(gè)重要指標(biāo)，急性重復(fù)低氧模型的典型表現(xiàn)是低氧耐受時(shí)間隨低氧次數(shù)增加呈線性遞增［9］。在有氧受到限制的條件下，腦組織中ATP的含量一過(guò)性降低，隨低氧暴露次數(shù)增加，ATP含量升高，重復(fù)低氧暴露可使腦組織中ATP水平有所升高［10］，本實(shí)驗(yàn)方法測(cè)得的大鼠腦組織中ATP與以往文獻(xiàn)［10］報(bào)道結(jié)果一致，表明本方法測(cè)定的數(shù)據(jù)可信。

目前磷酸腺苷的測(cè)定方法還有薄層掃描法［11］及酶學(xué)［12］等方法，但整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程很繁瑣。高效液相色譜-可變波長(zhǎng)檢測(cè)法應(yīng)是一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可信的測(cè)定磷酸腺苷的方法，可適用于低氧損傷的基礎(chǔ)與臨床相關(guān)研究。

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