何艷姣 喬 超 劉朝霞 俞 進(jìn) 李 光

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院病理科，北京 100050)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在我國逐年增高并逐漸趨于年輕化，嚴(yán)重威脅婦女生命健康。從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑治療腫瘤是目前生物治療的新興領(lǐng)域。Wnt信號通路是目前已知的胚胎發(fā)育所必需的信號通路，經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路致癌的關(guān)鍵是該途徑任何一個信號分子異常導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)/核內(nèi)累積，研究［1-2］表明，在多種人類腫瘤均發(fā)現(xiàn) βcatenin異常表達(dá)和β-catenin基因突變，并與腫瘤發(fā)生相關(guān)，cyclinD1、c-myc是Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路非常重要的靶基因，本研究擬通過檢測正常乳腺組織、乳腺增生癥和乳腺癌中β-catenin、cyclinD1、c-myc的表達(dá)情況，評價它們的異常表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系，同時做β-catenin異常表達(dá)與cyclinD1、c-myc過表達(dá)相關(guān)性研究，旨在初步探討Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要因子β-catenin及其靶基因cyclinD1、c-myc與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

取自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院病理科40例正常乳腺組織、72例乳腺增生癥及119例乳腺癌標(biāo)本及臨床資料，所有病例均經(jīng)病理證實(shí)。常規(guī)10%中性甲醛固定、石蠟包埋。切片厚度4 μm，常規(guī)HE染色。

1.2 免疫組化染色

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，染色方法按S-P試劑盒說明書步驟進(jìn)行，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)微波修復(fù)18 min行抗原修復(fù)，第一抗體(鼠抗人β-catenin、cyclinD1、c-myc單克隆即用型抗體均購自北京中杉金橋公司)4℃過夜。經(jīng)DAB顯色后，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。陰性對照采用0.01 mol/L PBS(pH=7.4)液體代替一抗，其他步驟不變。S-P及DAB試劑盒均購自北京中杉金橋公司。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

在正常情況下β-catenin陽性染色定位于細(xì)胞膜，即連續(xù)的細(xì)胞膜染色。染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)按Maruyama K等［3］的方法，分別從細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核3方面判斷β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的分布:細(xì)胞膜＞70%細(xì)胞陽性為正常表達(dá)，反之為表達(dá)缺失;細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核＞10%細(xì)胞陽性為胞質(zhì)或胞核陽性表達(dá)，胞質(zhì)或胞核表達(dá)為異位表達(dá)。異位表達(dá)和表達(dá)缺失統(tǒng)歸為異常表達(dá)。

cyclinD1表達(dá)于細(xì)胞核，c-myc在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均可出現(xiàn)陽性，隨機(jī)選取10個高倍視野，每個視野計(jì)數(shù)100個瘤細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞百分比，＞10%為過度表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，采用卡方檢驗(yàn)和確切概率法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌、乳腺增生癥及正常乳腺組織中β-catenin、cyclinD1、c-myc的表達(dá)情況

119例乳腺癌中26例 β-catenin正常表達(dá)(圖1A)，正常表達(dá)率為21.85%。93例β-catenin異常表達(dá)(圖1B)，異常表達(dá)率為78.15%;69例cyclinD1陽性表達(dá)(圖1C)，陽性表達(dá)率為57.98%;67例 c-myc陽性表達(dá)(圖1D)，陽性表達(dá)率為56.30%。

圖1 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織SP法免疫組化染色結(jié)果Fig.1 Breast infiltrating ductal cancer by immunohistochemistry SP method(200×)

72例乳腺增生癥中β-catenin的異常表達(dá)率為44.44%(32/72)，cyclinD1 的陽性表達(dá)率為 33.33%(24/72)，c-myc的陽性表達(dá)率為 27.78%(20/72)。

40例正常乳腺組織中β-catenin在細(xì)胞膜中強(qiáng)表達(dá)，cyclinD1及c-myc陰性表達(dá)。乳腺癌β-catenin異常表達(dá)率明顯高于乳腺增生癥，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，乳腺癌cyclinD1陽性表達(dá)率高于乳腺增生癥，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，乳腺癌c-myc陽性表達(dá)率高于乳腺增生癥，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.2 β-catenin、cyclinD1、c-myc的表達(dá)與乳腺癌臨床病理資料相關(guān)性

β-catenin、cyclinD1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P=0.031，P=0.003)，與年齡、部位、腫瘤大小、組織學(xué)類型無關(guān)，c-myc的表達(dá)與腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P均=0.041)，與年齡、部位、組織學(xué)類型無關(guān)，見表1。

表1 β-catenin、cyclinD1、c-myc的表達(dá)與乳腺癌臨床病理資料相關(guān)性Tab.1 The relationship between β-catenin，cyclinD1，c-myc and clinicopathological index in breast carcinoma n(%)

2.3 乳腺癌中 β-catenin的異常表達(dá)與cyclinD1、cmyc的表達(dá)相關(guān)性

β-catenin的異常表達(dá)與 cyclinD1的表達(dá)相關(guān)(P=0.006)，與 c-myc的表達(dá)無關(guān)，見表2。

表2 乳腺癌中β-catenin的異常表達(dá)與cyclinD1、c-myc的表達(dá)相關(guān)性Tab.2 The relationship between expression of β-catenin and cyclinD1，c-myc in breast carcinoma

3 討論

經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路致癌的關(guān)鍵是該途徑任何一個信號分子異常致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)/核內(nèi)累積。β-catenin是一種多功能細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的可溶性蛋白，由于它在細(xì)胞黏附和增生過程中的雙重作用，已成為腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究中的熱點(diǎn)。近來研究［4］表明，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)和核內(nèi)的累積是惡性腫瘤中的常見事件之一，在結(jié)直腸腺瘤和癌等多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)β-catenin異常表達(dá)并與腫瘤發(fā)生相關(guān)，但在乳腺癌中的報(bào)道結(jié)果不一致。Bankfalvi A等［5］發(fā)現(xiàn)從乳腺正常組織到浸潤癌的發(fā)展過程中β-catenin膜表達(dá)下調(diào)，認(rèn)為β-catenin的改變是乳腺癌發(fā)生過程中的早期事件。Lin S Y等［6］、Lim S C 等［7］、López-Knowles E 等［8］報(bào)道了乳腺癌中β-catenin的異常表達(dá)與預(yù)后不良有關(guān)，可以作為乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后因子。而Chung G G等［9］研究表明β-catenin異常表達(dá)與預(yù)后無關(guān)，只有同時存在β-catenin異常表達(dá)和p53高表達(dá)時才與預(yù)后不良有關(guān)，因此，βcatenin不能作為乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后因子。王珂等［10］研究表明β-catenin異常表達(dá)與Her2陽性表達(dá)有關(guān)，二者異常表達(dá)協(xié)同促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌β-catenin異常表達(dá)率明顯高于乳腺增生癥，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明β-catenin異常表達(dá)在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。同時發(fā)現(xiàn)βcatenin的異常表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，表明其可以用于評價乳腺癌的預(yù)后。

CyclinD1和c-myc作為原癌基因，參與細(xì)胞的增生、分化與凋亡，并且與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。近來研究［1-2］顯示，cyclinD1、c-myc是Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路非常重要的靶基因，免疫組化研究證實(shí)在多種腫瘤中cyclinD1、c-myc過表達(dá)與β-catenin異常表達(dá)和Wnt突變有關(guān)。在乳腺癌中，僅有少數(shù)研究報(bào)道了β-catenin異常表達(dá)與cyclinD1、c-myc過表達(dá)的相關(guān)性，且意見不一致，如 Ozaki S等［11］研究顯示β-catenin異常表達(dá)與 cyclinD1、c-myc過表達(dá)有關(guān)，Roh M S 等［12］研究顯示β-catenin異常表達(dá)可上調(diào)c-myc表達(dá)，Lin S Y等［6］證實(shí)β-catenin異常表達(dá)與cyclinD1高表達(dá)相關(guān)，Lim S C等［7］研究顯示 β-catenin異常表達(dá)與 cyclinD1過表達(dá)無關(guān)。本研究顯示cyclinD1、c-myc的過表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，表明它們也可以作為評價乳腺癌轉(zhuǎn)移、預(yù)后的重要因子。同時β-catenin異常表達(dá)與cyclinD1過表達(dá)相關(guān)，而與c-myc過表達(dá)無關(guān)，表明β-catenin在乳腺癌發(fā)生過程中的作用可能是通過上調(diào)cyclinD1的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解和細(xì)胞增生分化失控而實(shí)現(xiàn)的。

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