王志君,宋洪杰,陸松偉,尤本明(第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院藥學(xué)部,上海 200433)

珍珠維E乳膏是第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院皮膚科臨床用于治療黃褐斑、雀斑、老年斑及日曬斑等皮膚病的一種特色制劑,主要成分有維生素B6、維生素E和尿素。原質(zhì)量標(biāo)準僅測定尿素含量,對反映藥效的維生素B6和維生素E未建立質(zhì)控方法。本研究建立了梯度洗脫RP-HPLC法同時測定珍珠維E乳膏中維生素B6和維生素E的含量,旨在更好地控制珍珠維E乳膏的質(zhì)量。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 LC-10ADVP高效液相色譜儀,包括

LC-10AT泵 、SPD-10A 紫外檢測器 、CLASS vp色譜工作站和SCL-10Avp系統(tǒng)控制器(日本島津制作所);FA-2004電子天平(萬分之一,上海天平儀器廠);CPS-3超聲波粉碎機(上海聲譜有限公司)。

1.2 藥品和試劑 維生素E對照品(藥用,含量99.8%,浙江天新藥業(yè)有限公司,批號1003221),維生素B6對照品(藥用,含量99.9%,浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠,批號100503);珍珠維 E乳膏(本院藥學(xué)部制劑室提供,批號 110325、110411和110415);甲醇(色譜純,美國 Tedia公司,批號1011900);無水乙醇和磷酸均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液制備[1-3]取本品適量(約相當(dāng)于維生素B6和維生素E含量均為1.0 mg)精密稱定,置于燒杯中,加90%乙醇溶液80 ml,采用超聲破碎10 min,轉(zhuǎn)移至100 ml量瓶,洗滌燒杯,合并洗滌液至量瓶,50℃水浴加熱5 min,冷卻后加90%乙醇溶液至刻度,搖勻,過濾后備用。

2.1.2 模擬樣品和陰性對照溶液制備 按處方工藝制備不含維生素B6、維生素E的陰性對照樣品,以及維生素B6、維生素E含量分別為標(biāo)示量80%、100%、120%的模擬樣品,測定溶液的配制同2.1.1項下方法。

2.1.3 對照品溶液配制 精密稱取維生素B6對照品及維生素E對照品各50 mg,分別置50 ml量瓶中,前者加水,后者加甲醇溶解稀釋至刻度,搖勻,制得維生素B6對照品及維生素E對照品儲備液。分別精密量取維生素B6、維生素E對照品儲備液適量,加80%甲醇溶液稀釋至刻度,制得混合對照品溶液;維生素 E和維生素 B6濃度范圍均為 1.0、5.0 、10.0 、20.0 、50.0 μ g/ml。

2.2 色譜條件和系統(tǒng)適用性實驗[4]色譜柱:Kromasil-C18柱(150 mm ×4.6 mm,5 μ m)。流動相:甲醇(A液)-0.2%磷酸溶液(B液),梯度洗脫,0～4.5 min,A ∶B=86∶14;4.5～18 min,A ∶B=100∶0;18～25 min,A ∶B=86∶14。檢測波長 285 nm;流速 1.0 ml/min;進樣量 20 μ l;柱溫為室溫。維生素B6、維生素E與相鄰峰的分離度都＞1.5,陰性對照不干擾樣品測定。陰性樣品、對照品和樣品的色譜圖見圖1。

圖1 珍珠維E乳膏的RP-HPLC譜圖Figure 1 RP-HPLCphotograms of Pearl vitamin E cream

2.3 標(biāo)準曲線繪制 精密吸取2.1.3項下混合對照品溶液各20 μ l,進樣,測定峰面積。以對照品溶液濃度(c,μ g/ml)為橫坐標(biāo),峰面積(A)為縱坐標(biāo),求得維生素B6和維生素E的線性回歸方程。維生素B6的線性回歸方程為 A=38467 c+2472.2(r=0.999 9,n=5),維生素E的線性回歸方程為A=5 217.3 c-1 624.8(r=0.999 8,n=5),表明各成分在所選定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 回收率實驗 分別取模擬樣品溶液各20 μ l,進樣,記錄峰面積,代入線性回歸方程,計算含量并求算回收率。維生素B6的平均回收率為(95.32±0.27)%(n=9),維生素E的平均回收率為(96.91±0.85)%(n=9),表明實驗方法的回收率滿足測定要求。

2.5 精密度實驗 (1)分別取低、中、高(5.0、10.0、20.0 μ g/ml)3 組濃度的混合對照品溶液各 20 μ l,在2.2項色譜條件下,重復(fù)進樣3次,日內(nèi)精密度每次進樣間隔時間為4 h,日間精密度每次進樣間隔時間為24 h。記錄峰面積,計算峰面積變異系數(shù)。維生素B6低、中、高3個濃度峰面積的日內(nèi)RSD分別為0.11%、0.23%和0.41%(n=3),維生素E峰面積的日內(nèi)RSD分別為0.60%、0.94%和0.32%(n=3)。維生素B63個濃度峰面積的日間RSD分別為1.18%、0.79%和0.43%(n=3),維生素E峰面積的日間RSD分別為1.34%、1.34%和0.87%(n=3),表明實驗方法的日內(nèi)、日間精密度滿足測定要求。

2.6 重復(fù)性實驗 取珍珠維E乳膏(批號110411)的供試品溶液6份,進樣,測定峰面積并計算含量,維生素B6和維生素E的 RSD分別為0.68%和0.74%(n=6)。

2.7 穩(wěn)定性實驗 在供試品溶液配制后的8 h內(nèi),每隔2 h測定一次。維生素B6和維生素E的RSD分別為0.70%和0.74%(n=5),表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 樣品測定 分別取3批樣品的供試品溶液各20 μ l,進樣,記錄峰面積,代入線性回歸方程,計算含量,并求算兩組分相當(dāng)于標(biāo)示量的百分比,結(jié)果見表1。3批樣品中維生素B6和維生素E的平均含量分別為標(biāo)示量的(94.91±0.77)%和(96.87±0.85)%,均在標(biāo)示量的90.0%～110.0%,符合外用制劑的含量測定要求。

3 討 論

維生素B6為水溶性維生素,不易在C18柱中保留,出峰早,而維生素E為脂溶性維生素,易在C18柱中保留,出峰晚。在HPLC法中,采用梯度洗脫方式,可減少維生素E在C18柱中的保留。另外研究發(fā)現(xiàn),采用甲醇-水(75∶25或80∶20)作為流動相時維生素B6峰分別裂解為2個峰和3個峰,同時拖尾情況嚴重,當(dāng)在流相中加入0.2%磷酸溶液,峰形對稱性獲得改善。維生素B6在甲醇-0.2%磷酸溶液(80∶20)條件下保留時間為3.6 min,甲醇的比例增加或減少,維生素B6的保留時間均有延長的趨勢;為使維生素B6與雜質(zhì)峰完全分離且峰形較好,在梯度洗脫的起始階段使用甲醇-0.2%磷酸溶液(86∶14)為色譜條件。

表1 珍珠維E乳膏中維生素B6和維生素E的含量測定結(jié)果Table 1 Contents of vitamin B6and vitamin E in Pearl vitamin E cream

表1 珍珠維E乳膏中維生素B6和維生素E的含量測定結(jié)果Table 1 Contents of vitamin B6and vitamin E in Pearl vitamin E cream

批號標(biāo)示量(1%)的百分含量維生素 B6 維生素E 110325 95.21±0.76 97.22±0.85 110411 95.44±0.72 97.45±0.93 110415 94.08±0.87 95.53±0.56

樣品提取方法研究過程中,為得到良好的破乳效果和符合測定要求的提取率,先后采用2%吐溫80溶液和1%磷酸溶液,以及80%甲醇氯化鈉飽和溶液提取樣品。結(jié)果表明,2%吐溫80溶液對維生素B6檢測有干擾,1%磷酸溶液易造成基線不穩(wěn),使用80%甲醇氯化鈉飽和溶液提取樣品反而降低維生素B6的提取率,以上3種溶液均不適宜做為樣品測定的提取溶液。最后采用先超聲破碎,后水浴加熱的提取方法,獲得相對理想的回收率。

維生素B6和維生素E的最大吸收波長分別為291 nm[5]和285 nm,但在本研究流動相條件下相同濃度的維生素B6的吸收度值較維生素E要高,故選擇285 nm作為同時測定的波長。

經(jīng)方法學(xué)研究表明,本研究所建立的RP-HPLC法準確性和重復(fù)性好,可用于同時測定珍珠維E乳膏中維生素B6和維生素E的含量。

[1] 楊少芳,陳渝軍,林 晶,等.高效液相色譜法測定復(fù)方維生素B6乳膏中維生素B6和醋酸潑尼松的含量[J].中國藥師,2005,8(7):552-554.Yang ShaoFang,Chen YuJun,Lin Jing,et al.Determination of vitamin B6and prednisone acetate in compound vitamin B6cream by RP-HPLC[J].China Pharmacist,2005,8(7):552-554.Chinese with abstract in English.

[2] 葉光明,于曉華,陳云紅,等.復(fù)方二氧化鈦軟膏中防曬劑的鑒別和含量測定[J].藥學(xué)服務(wù)與研究,2008,8(4):261-263.Ye GuangMing,Yu XiaoHua,Chen YunHong,et al.Identification and quantitative determination of sunscreen agents in compound titanium dioxide ointment[J].Pharm Care Res,2008,8(4):261-263.Chinese with abstract in English.

[3] 汪民海.維生素B6片含量測定中溶解方法的探討[J].安徽醫(yī)藥,2004,9(2):119.Wang MinHai.Study on a solution method in the determination of VitB6tablets[J].AnHui Med Pharm J,2004,9(2):119.Chinese with abstract in English.

[4] 臧亞茹.高效液相色譜法同時測定復(fù)方壬二酸乳膏中維生素C與維生素E的含量[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2007,27(8):1171-1172.Zang YaRu.Simultaneous determination of vitamin C and vitamin E in compound azelaic acid cream by HPLC[J].Chin J Hosp Pharm,2007,27(8):1171-1172.Chinese.

[5] 陳 旻,李晨輝,劉 佳.HPLC法測定維生素B6軟膏的含量[J].中國藥品標(biāo)準,2006,7(5):67-69.Chen Min,Li ChenHui,Liu Jia.Content determination of vitamin B6ointment by HPLC[J].Drug Standards China,2006,7(5):67-69.Chinese with abstract in English.