黃勤挽，王瑾，蘇娟，張玉莉，何劍（.成都中醫(yī)藥大學中藥資源系統研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，成都市 637；.四川廣元億明生物科技有限公司，廣元市 6800）

杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.，常用藥用部位為樹皮和樹葉，具有補肝腎、強筋骨、安胎等功效，常用于肝腎不足、腰膝酸痛、筋骨無力、頭暈目眩、妊娠漏血、胎動不安的治療，是我國名貴的滋補藥材之一，其藥用歷史悠久，臨床應用廣泛[1，2]。

杜仲為落葉喬木，花單性，雌雄異株。雄花是杜仲雄樹開的花，以前僅用作傳粉授精，近年來被開發(fā)出新的利用途徑?，F代研究表明，杜仲雄花含有同樹皮、樹葉類似的多種藥效物質成分[3]。本課題組采用雙波長高效液相色譜（HPLC）法同時測定杜仲雄花中京尼平苷酸、綠原酸、梔子苷3種成分的含量，以對其質量進行控制。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型HPLC儀，包括四元泵、DAD檢測器、柱溫箱、自動進樣器、色譜工作站（美國Agilent公司）；BP211D電子天平（德國Sartorius公司）；SB2200超聲波發(fā)生器（中美合資上海必能信超聲有限公司）。

杜仲雄花（廣元億明生物科技有限公司提供，批號:20110401、20110402、20110403，產地:四川省旺蒼縣），經成都中醫(yī)藥大學標本中心盧先明教授鑒定為杜仲科植物杜仲E.ulmoides Oliv.的雄花；梔子苷（批號:110749-200613，供含量測定用）、綠原酸（批號:110753-200413，供含量測定用）對照品均由中國藥品生物制品檢定所提供；京尼平苷酸標準品（供含量測定用，含量:99.3%）由成都瑞芬思生物科技有限公司提供；甲醇為色譜純，水為樂百氏純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 混合對照品溶液的制備

取京尼平苷酸標準品與綠原酸、梔子苷對照品各適量，分別精密稱定，置同一量瓶中，加甲醇制成每1mL分別含0.0892、0.1052、0.1024mg的溶液，搖勻，即得。

2.2 供試品溶液的制備

取杜仲雄花粗粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇50mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率:180 W，頻率:40 kHz）60min，放冷，再稱定重量，用60%甲醇補足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱:Agilent Zorbax Extend C18（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相:甲醇-水-醋酸（15∶85∶1）；流速:1mL·min-1；檢測波長:238 nm（檢測京尼平苷酸和梔子苷）和327 nm（檢測綠原酸）；柱溫:30℃。理論板數按京尼平苷酸峰計算應不低于2000。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對照品（檢測波長238 nm）；B.混合對照品（檢測波長327 nm）；C.杜仲雄花（檢測波長238 nm）；D.杜仲雄花（檢測波長327 nm）；1.京尼平苷酸；2.綠原酸；3.梔子苷Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed control（detection wavelength 238 nm）；B.mixed control（detection wavelength 327 nm）；C.male flowers of E.ulmoides（detection wavelength 238 nm）；D.male flowers of E.ulmoides（detection wave length 327 nm）；1.geniposidic acid；2.chlorogenic acid；3.geniposide

2.4 線性關系考察

精密吸取混合對照品溶液1、2、10、30、60μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定。以進樣量（X，μg）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得京尼平苷酸、綠原酸、梔子苷的回歸方程分別為Y＝772.7X+100.9（r＝0.9995，n＝5）、Y＝1226X+71.71（r＝0.9995，n＝5）、Y＝1152X+93.96（r＝0.9995，n＝5）。結果表明，三者進樣量分別在0.0892～5.3520、0.1052～6.3120、0.1024～6.1440μg范圍內與各自峰面積積分值呈良好線性關系。

2.5 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液10μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結果，京尼平苷酸、綠原酸、梔子苷峰面積的RSD分別為1.08%、1.22%、1.25%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

取杜仲雄花粗粉（批號:20110401）約0.5 g，共6份，分別精密稱定，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按上述方法測定，計算3種成分的含量。結果，京尼平苷酸、綠原酸、梔子苷含量平均值的RSD分別為1.37%、1.55%、1.76%，表明方法重復性良好（n＝6）。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取杜仲雄花粗粉（批號:20110401）約0.5 g，精密稱定，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，于制備后0、1、2、4、8、12 h進樣測定，計算3種成分的含量。結果，京尼平苷酸、綠原酸、梔子苷含量平均值的RSD分別為1.24%、1.39%、1.41%（n＝6），表明杜仲雄花供試品溶液中京尼平苷酸、綠原酸、梔子苷在12 h內基本穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗

稱取已測知含量的杜仲雄花粗粉（批號:20110401）6份，每份約0.25 g，分別加入上述3種對照品適量，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，計算加樣回收率，結果見表1～表3。

表1 京尼平苷酸的加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests of geniposidic acid（n＝6）

表2 綠原酸的加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 2 Result of recovery tests of chlorogenic acid（n＝6）

表3 梔子苷的加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 3 Result of recovery tests of geniposide（n＝6）

2.9 樣品含量測定

取杜仲雄花樣品3批，每批平行3份，分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定含量，結果見表4。

表4 杜仲雄花含量測定結果（%，n＝3）Tab 4 Results of content determination of male flower of E.ulmoides（%，n＝3）

3 討論

已見同時測定杜仲雄花中京尼平苷酸、綠原酸和梔子苷含量的文獻報道，但系采用單波長進行測定的方法，其中綠原酸未在其最大吸收峰處定量檢測[4]。本課題組采用DAD檢測器，設定的雙波長法能簡便、準確、快速地對杜仲雄花中3種成分的含量進行測定，結果滿意。在原有中藥單一成分質量控制模式下，普通的單波長檢測器能夠勝任，但隨著中藥質量控制要求的提高，進行中藥多成分質量控制模式是發(fā)展的必然趨勢[5]，需要VWD或DAD檢測器應用。除本文使用的雙波長全程直接檢測外，還可在分析過程中進行雙波長或多波長切換，即進行波長梯度檢測[6]。雙波長法或多波長法能方便、快速地對中藥中多種成分同時測定，能滿足中藥多成分質量控制的要求。

[1]張康健，王 藍，馬希漢.杜仲的綜合開發(fā)的進展與前景[J].西北林學院學報，1996，11（2）:75.

[2]冉懋雄，周厚瓊.對杜仲葉深度開發(fā)的思考與建議[J].中國藥房，1998，9（5）:203.

[3]董娟娥，梁宗鎖，張康健，等.杜仲雄花中次生代謝物合成積累的動態(tài)變化[J].植物資源與環(huán)境學報，2005，14（4）:7.

[4]李 欽，杜紅巖，杜蘭英，等.HPLC法測定杜仲雄花和杜仲雄花茶中京尼平苷酸、綠原酸和京尼平苷[J].中草藥，2009，40（1）:71.

[5]郝旭亮，張永文.中藥質量標準中建立多指標含量測定的必要性淺析[J].中國執(zhí)業(yè)藥師，2009，9:31.

[6]田笑菲，李 清，梁 可，等.RP-HPLC雙波長切換法同時測定復方酸棗仁顆粒中芒果苷和斯皮諾素[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（11）:52.