張志亮，呂楊（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新鄉(xiāng)市 453003；.河南大學(xué)藥學(xué)院，開封市 475001）

健脾潤肺片是根據(jù)健脾潤肺丸改劑型而成的中藥新藥品種，由五味子、麥冬、制何首烏、當(dāng)歸、黃芪、黃芩、陳皮、黃精、地黃、白芍、山藥、天冬、百合、知母、柴胡、茯苓、白術(shù)、川貝母、北沙參、黨參、山茱萸、丹參、雞內(nèi)金、山楂、阿膠、瓜蔞、白及、甘草等28味藥材經(jīng)提取制成。具有滋陰潤肺、止咳化痰、健脾開胃之功效，用于治療癆瘵、肺陰虧耗、潮熱盜汗、咳嗽咯血、食欲減退、氣短無力、肌肉瘦削等肺癆諸證，并可輔助治療抗癆藥物引起的肝功能損害。因蜜丸劑服用不便，不易貯藏、運(yùn)輸、攜帶，外觀較差，故在保持健脾潤肺丸原有藥效基礎(chǔ)上，在生產(chǎn)工藝無質(zhì)的改變條件下改劑型為片劑，不但工藝簡便，而且外觀美觀、攜帶方便。

本品為中藥復(fù)方制劑，處方藥味較多。其中當(dāng)歸、五味子、麥冬、黃芪、制何首烏、黃芩、陳皮是處方量較大的重要藥味，筆者根據(jù)規(guī)定采用薄層色譜（TLC）法對上述藥味進(jìn)行定性鑒別；五味子為方中君藥，具有斂肺滋腎、生津斂汗、澀精止瀉、寧心安神之功效。五味子醇甲為其主要有效成分之一，故對五味子醇甲進(jìn)行含量測定。據(jù)文獻(xiàn)報道，五味子醇甲的含量測定方法主要有薄層掃描法[1]、紫外分光光度法[2]和高效液相色譜（HPLC）法[3]等。本文采用與2010年版《中國藥典》（一部）五味子含量測定項下[4]相一致的HPLC法進(jìn)行試驗。

1 儀器與試藥

超聲波提取器（濟(jì)寧市金百特生物機(jī)械有限公司，總功率:14.4 kW，工作頻率:20 kHz）；10Avp HPLC儀，包括LC-10ATvp雙泵、SPD-M10Avp二極管陣列檢測器、SIL-10ADvp自動進(jìn)樣器、CTO-10Avp柱溫箱（日本島津公司）。

健脾潤肺片（ 批號:20051216、20051218、20051220、20051222、20051224、20051226、20051228、20060104、20060106、20060108）由湖南安邦制藥有限公司提供；五味子醇甲、五味子甲素、黃芪甲苷、黃芩苷、橙皮苷對照品和當(dāng)歸、五味子、麥冬、制何首烏對照藥材（中國藥品生物制品檢定所，批號分別為 110857-200304、0764-200006、0781-200311、0715-9909、110721-20021、0736-200014、0992-0301、0995-0312、0736-200014）；硅膠G、硅膠GF254（青島裕民源硅膠試劑廠，批號分別為070520、070421）；聚酰胺薄膜（臺州市路橋四甲生化塑料廠，批號:070912）；乙腈、甲醇為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 定性鑒別

2.1 當(dāng)歸的TLC鑒別

取本品50片，研細(xì)，加水150mL，連接揮發(fā)油測定器，自測定器上端加水使充滿刻度部分，再加乙酸乙酯1mL，連接回流冷凝管，加熱回流1 h，停止加熱，放置片刻，分取乙酸乙酯層，作為供試品溶液；另取當(dāng)歸對照藥材1 g，加乙酸乙酯10mL，超聲處理15min，濾過，濾液濃縮至約2mL，作為對照藥材溶液；取缺當(dāng)歸的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備缺當(dāng)歸陰性對照溶液。照TLC法[4]試驗，吸取供試品溶液 5μL，對照藥材、陰性對照溶液各1μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（9∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；陰性對照無干擾。當(dāng)歸的TLC見圖1。

2.2 五味子的TLC鑒別

取本品50片，研細(xì)，加三氯甲烷30mL，加熱回流30min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作為供試品溶液；另取五味子對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液；再取五味子甲素對照溶品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液；取缺五味子的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備缺五味子陰性對照溶液。照TLC法[4]試驗，吸取上述4種溶液2、2、5、2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚（60～90℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對照無干擾。五味子的TLC見圖2。

2.3 麥冬的TLC鑒別

圖1 當(dāng)歸的TLC1～3.供試品；4.當(dāng)歸對照藥材；5.缺當(dāng)歸陰性對照Fig 1 TLC of Angelica sinensis1～3.test samples；4.Radix Angelicae Sinensis reference substance；5.negative control without A.sinensis

圖2 五味子的TLC1～3.供試品；4.五味子甲素對照品；5.五味子對照藥材；6.缺五味子陰性對照Fig 2 TLC of Schisandrae chinensis1～3.test samples；4.deoxyschizandrin control；5.Fructus Schisandrae Chinensis reference substance；6.negative control without S.chinensis

取本品30片，研細(xì)，加水30mL、鹽酸3mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液用三氯甲烷振搖提取2次，每次20mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘渣加三氯甲烷2mL使溶解，作為供試品溶液；另取麥冬對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液；取缺麥冬的陰性樣品，同法制備缺麥冬陰性對照溶液。照TLC法[4]試驗，分別吸取上述3種溶液1、2、2μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮（4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對照無干擾。麥冬的TLC見圖3。

2.4 黃芪的TLC鑒別

取本品30片，研細(xì)，加三氯甲烷50mL，超聲處理30min，濾過，棄去三氯甲烷液，揮干藥渣上殘留溶劑，再加甲醇50mL，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水25mL，微熱使溶解，再加乙酸乙酯20mL，萃取，棄去乙酸乙酯液，水溶液用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次25mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次25mL，棄去氨液，蒸干正丁醇液，殘渣加甲醇2mL使溶解，作為供試品溶液；另取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液；取缺黃芪的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備缺黃芪陰性對照溶液。照TLC法[4]試驗，分別吸取上述3種溶液各2μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對照無干擾。黃芪的TLC見圖4。

2.5 制何首烏的TLC鑒別

取本品30片，研細(xì)，加乙醇50mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水25mL微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次25mL，合并正丁醇液，用水洗滌2次，每次25mL，棄去水液，蒸干正丁醇液，殘渣加甲醇4mL使溶解，作為供試品溶液；另取制何首烏對照藥材0.25 g，加乙醇50mL，加熱回流1 h，濾過，濾液濃縮至約3mL，作為對照藥材溶液；取缺制何首烏的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備缺制何首烏陰性對照溶液。照TLC[4]法試驗，吸取上述供試品溶液1μL、對照藥材溶液5μL、陰性對照溶液3μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-乙醇（2∶1）為展開劑，展至約3.5cm，取出，晾干，再以苯-乙醇（4∶1）為展開劑，展至約7cm，取出，晾干，噴以磷鉬酸硫酸溶液（取磷鉬酸2 g，加水20mL使溶解，再緩緩加入硫酸30mL，搖勻，即得），熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對照無干擾。制何首烏的TLC見圖5。

圖3 麥冬的TLC1～3.供試品；4.麥冬對照藥材；5.缺麥冬陰性對照Fig 3 TLC of Ophiopogon japoncius1～3.test sample；4.Radix Ophiopogonis reference substance；5.negative control without O.japoncius

圖4 黃芪的TLC1～3.供試品；4.黃芪甲苷對照品；5.缺黃芪陰性對照Fig 4 TLC of Astragalus membranaceus1～3.test sample；4.astragalosideⅡ control；5.negative control withoutA.membranaceus

2.6 黃芩的TLC鑒別

取“2.5”項下的供試品溶液，作為該項供試品溶液；另取黃芩苷對照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液；取缺黃芩的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備缺黃芩陰性對照溶液。照TLC法[4]試驗，吸取上述供試品溶液、對照品溶液各1～2μL、陰性對照溶液2μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸（8∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對照無干擾。黃芩的TLC見圖6。

2.7 陳皮的TLC鑒別

取“2.5”項下的供試品溶液，作為該項供試品溶液；另取橙皮苷對照品，加甲醇制成飽和溶液，作為對照品溶液；取缺陳皮的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備缺陳皮陰性對照溶液。照TLC[4]法試驗，吸取上述3種溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一用0.5%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶72）10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；陰性對照無干擾。陳皮的TLC見圖7。

圖5 制何首烏的TLC1～3.供試品；4.何首烏對照藥材；5.缺何首烏陰性對照Fig 5 TLC of processed Polygonum multiflorum1～3.test samples；4.Radix Polygoni Multiflori control；5.negative control without P.multitflorum

圖6 黃芩的TLC1～3.供試品；4.黃芩苷對照品；5.缺黃芩陰性對照Fig 6 TLC of Scutellaria baicalensis1～3.test samples；4.baicalin control；5.negative control without S.baical-∶ensis

3 浸出物的測定

取本品20片，除去包衣，研細(xì)，取3 g，精密稱定，精密加入75mL正丁醇，按熱浸法[4]進(jìn)行試驗，測定10批樣品中的正丁醇浸出物含量。結(jié)果，10批（批號:20051216、20051218、20051220、 20051222、 20051224、 20051226、 20051228、20060104、20060106、20060108）樣品中的正丁醇浸出物含量分別為每片 37.84、46.68、67.40、38.31、58.48、47.17、52.59、48.47、47.34、48.50mg。

4 含量測定

4.1 色譜條件

色譜柱:Hypersil ODS填料色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），填充劑:十八烷基硅烷鍵合硅膠；柱溫:35℃；流速:1mL·min-1；流動相:甲醇-水（65∶35）；檢測波長:250 nm；進(jìn)樣量:10μL。理論板數(shù)按五味子醇甲峰計算不低于2000。

4.2 檢測波長的確定

以島津SPD-M10Avp二極管陣列檢測器對五味子醇甲對照品和供試品中五味子醇甲吸收峰于210～390 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行吸收光譜測定。結(jié)果，二者均在250 nm波長處有較強(qiáng)的吸收，且供試品和對照品色譜中的五味子醇甲峰的紫外吸收光譜基本一致?？紤]到2010年版《中國藥典》（一部）五味子藥材項下測定波長為250 nm，故將本品中五味子醇甲含量測定的檢測波長選定為250 nm。

4.3 對照品溶液的制備

精密稱取干燥的五味子醇甲對照品2.08mg，置10mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取5mL，置25mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（每1mL含五味子醇甲41.6μg）。

4.4 供試品溶液的制備

取重量差異項下的本品，研細(xì)，取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，稱定重量，超聲處理20min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過。濾液用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

4.5 陰性對照試驗

取缺五味子的陰性樣品，按“4.4”項下方法制備陰性對照溶液。分別吸取五味子醇甲供試品溶液、對照品溶液和陰性對照溶液各10μL，注入液相色譜儀，照上述色譜條件測定。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的保留時間處，有相似的吸收峰；陰性對照色譜則在相應(yīng)的保留時間處無相對應(yīng)的吸收峰出現(xiàn)。色譜見圖8。

圖7 陳皮的TLC1～3.供試品；4.橙皮苷對照品；5.缺陳皮陰性對照Fig 7 TLC of Citrus retlculatae1～3.test sample；4.hesperidin control；5.negative control without C.reticulatae

圖8 高效液相色譜圖A.五味子醇甲對照品；B.供試品；C.缺五味子陰性對照Fig 8 HPLC chromatogramsA.schisandrin A control；B.test sample；C.negative control without Schisandrae chinensis

4.6 線性關(guān)系考察

精密吸取五味子醇甲對照品溶液（濃度為0.0416mg·mL-1）5、10、15、20、25μL，分別注入液相色譜儀測定。以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，五味子醇甲峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝2.32784×106X+6295.58（r＝0.9999，n＝5）。結(jié)果表明，五味子醇甲進(jìn)樣量在5～25μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

4.7 穩(wěn)定性試驗

取樣品（批號:20060106）適量，按“4.4”項下方法制備供試品溶液，分別于0、1、2、4、6、8 h照上述色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，RSD＝0.69%（n＝6），表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

4.8 精密度試驗

取樣品（批號:20060106）適量，按“4.4”項下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣測定6次。結(jié)果，RSD＝1.88%（n＝6），表明方法精密度良好。

4.9 重復(fù)性試驗

取樣品（批號:20060106）適量，共6份，分別按“4.4”項下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，RSD＝1.82%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

4.10 加樣回收率試驗

取已知含量（以每片0.118mg計為0.402mg·g-1）的同一批樣品（批號:20060106）約1 g，精密稱定，精密加入五味子醇甲對照品的甲醇溶液（0.0166mg·mL-1）25mL，按“4.4”項下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

4.11 樣品含量測定

取10批（批號:20051216、20051218、20051220、20051222、20051224、 20051226、 20051228、 20060104、 20060106、20060108）樣品，按“4.4”項下方法制備供試品溶液，照上述方法測定樣品中五味子醇甲含量。結(jié)果，10批樣品中每片含五味子醇甲的量分別為0.120、0.118、0.114、0.116、0.116、0.122、0.116、0.113、0.118、0.116mg。

5 討論

在試驗中，五味子以五味子甲素和五味子對照藥材為對照，黃芪、黃芩、陳皮分別以黃芪甲苷、黃芩苷、橙皮苷對照品為對照，當(dāng)歸、麥冬、制何首烏分別以當(dāng)歸、麥冬、制何首烏對照藥材為對照，根據(jù)測定成分的理化性質(zhì)制備供試品溶液。經(jīng)TLC分析，各供試品色譜中，在與對照品或?qū)φ账幉纳V相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，色譜斑點(diǎn)清晰、圓整，且同時進(jìn)行的陰性對照試驗結(jié)果均表明陰性對照無干擾，上述鑒別試驗具有較好的專屬性。

本試驗中曾對柴胡和白芍進(jìn)行定性鑒別，分別以柴胡對照藥材和芍藥苷對照品為對照，結(jié)果其供試品溶液在與對照藥材、對照品色譜相應(yīng)的位置上，均未能清晰檢出相同顏色的斑點(diǎn)，且其陰性對照色譜與供試品色譜均基本一致，故不收載入健脾潤肺片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。

在本品原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了當(dāng)歸的TLC鑒別方法，系采用三氯甲烷加熱回流提取制備供試品溶液，經(jīng)層析后置紫外光燈（365 nm）下檢視，結(jié)果供試品中雜質(zhì)較多，無法清晰檢出與對照藥材相對應(yīng)的熒光斑點(diǎn)。按本文“2.1”項下方法試驗，結(jié)果供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，可清晰檢出相對應(yīng)的藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，故對當(dāng)歸的原鑒別方法進(jìn)行了修訂。

黃芪中含有黃芪甲苷等皂苷類成分。由于本品中黃芪甲苷含量較少，且雜質(zhì)干擾較大，為獲得理想的TLC，根據(jù)黃芪甲苷的理化性質(zhì)，采用三氯甲烷脫脂、甲醇提取、加水溶解、水飽和的正丁醇萃取、氨試液洗滌等步驟對本品進(jìn)行提取、除雜，制備供試品溶液，按本文“2.4”項下方法試驗，色譜斑點(diǎn)清晰，陰性對照無干擾。

本品為中藥復(fù)方制劑，五味子為方中君藥。據(jù)文獻(xiàn)資料記載，五味子中含有木脂素類（五味子素、去氧五味子素、五味子醇甲、五味子醇乙等）、揮發(fā)油類、有機(jī)酸類、檸檬醛、葉綠素、甾醇、樹脂、鞣質(zhì)和少量糖類等成分[1]。五味子醇甲為五味子主要有效成分之一，能明顯促進(jìn)肝糖元的生成，降低肝內(nèi)谷丙酶的活性[5]。故以五味子醇甲作為五味子含量測定指標(biāo)，以更好地控制該藥品質(zhì)量，保證該藥品的臨床療效。

試驗結(jié)果表明，TLC法可定性檢出健脾潤肺片中當(dāng)歸、五味子、麥冬、黃芪、制何首烏、黃芩、陳皮，方法簡便、分離度好、專屬性強(qiáng)，陰性無干擾，可作為本品中以上諸藥的定性鑒別方法；HPLC法測定健脾潤肺片中五味子醇甲的含量，方法簡便、重復(fù)性好、準(zhǔn)確可靠，可作為本品的含量控制方法。

[1]苗明三，李振國.現(xiàn)代實用重要質(zhì)量控制技術(shù)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2000:199-207、482-483.

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[5]黃泰康.常用中藥成分與藥理手冊[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，1994:529-544.