郜琪臻,劉 慧,趙亞囡,丁平田*
聯(lián)苯芐唑是一種新型的氮取代性不含鹵素的咪唑類局部抗真菌藥,該藥物抗菌譜廣、抗菌活性高、皮膚滲透力強(qiáng)、療效確切、作用持久、且毒性低[1]。本藥能很好地透過被感染的皮膚,作用迅速且持續(xù)時(shí)間長,維持時(shí)間超過48 h。由于真菌菌絲可侵入角質(zhì)層深部,因此,抗真菌藥制劑的療效與其經(jīng)皮滲透能力有關(guān)。本試驗(yàn)以小型豬全皮皮膚為模型,應(yīng)用改良的Franz立式擴(kuò)散池,對受試聯(lián)苯芐唑進(jìn)行了體外經(jīng)皮透過評價(jià)。
1.1 儀器 透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀(TK-12B型),上海鎧凱科技貿(mào)易有限公司;改良的Franz立式擴(kuò)散池(有效透過面積3.14 cm2,接受池體積:7 mL,上海鎧凱科技貿(mào)易有限公司);HPLC色譜儀(SPD-10AVP),日本島津;HPLC工作站,YL-clarity(韓國)。
1.2 材料 聯(lián)苯芐唑原料藥(重慶青陽藥業(yè)有限公司,批號:090505,含量99.1%;由濟(jì)南三源藥業(yè)有限公司提供);對照市售聯(lián)苯芐唑乳膏(拜耳醫(yī)藥保健有限公司,批號:BAT/115976);受試聯(lián)苯芐唑乳膏(濟(jì)南三源藥業(yè)有限公司,批號:20091027);生理鹽水注射液(黑龍江七臺河制藥廠,批號:081225101);其余試劑為市售色譜純。小型豬(巴馬香豬,雄性),由重慶宗申醫(yī)達(dá)生物技術(shù)研發(fā)有限公司提供,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(渝)2010-0001。動物使用證:SYXK(渝)2010-0001。
2.1 離體皮膚的制備 將小型豬處死,機(jī)械法剪毛,剝?nèi)∑つw,切皮刀除去多余的脂肪組織,用生理鹽水洗干凈,放置冰箱(-70℃)中冷藏,備用。
2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性 色譜柱:Chromatorex C18(250 mm ×4.6 mm,5 μm);流動相:0.08 mol/L三乙胺(用磷酸調(diào)pH值為7.0)∶乙腈∶甲醇 =15∶17∶68;流速:1.0 mL/min;柱溫:25 ℃;檢測波長:254 nm;進(jìn)樣量:20 μL。
2.3 空白樣品的干擾試驗(yàn) 取離體小型豬皮膚,按透皮試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn),但是給藥池中不加藥物,以生理鹽水為接受液時(shí),取試驗(yàn)2、10 h的接受液;以PEG400∶生理鹽水(1∶2)為接受液時(shí),取試驗(yàn)2、10 h的接受液,過濾后進(jìn)樣測定,HPLC圖譜見圖1~圖3。
圖1 生理鹽水為接受液時(shí)空白樣品10 h
圖2 PEG400∶生理鹽水(1∶2)為接受液時(shí)空白樣品10 h
圖3 聯(lián)苯芐唑標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰
由圖3可見,聯(lián)苯芐唑保留時(shí)間為7.87 min,而空白樣品溶液在此保留時(shí)間無吸收,說明輔料不干擾聯(lián)苯芐唑測定。由圖3計(jì)算得到柱效為5 800,高于藥典規(guī)定的700,符合要求。
2.4 最低檢測限 采用企業(yè)提供的聯(lián)苯芐唑原料藥為工作對照品,精密稱取0.050 6 g(含量99.1%,相當(dāng)于聯(lián)苯芐唑0.050 1 g),加甲醇溶解稀釋成濃度為50 μg/mL的溶液,逐步稀釋,進(jìn)樣測定,選取HPLC圖譜基線噪音3倍者作為最低檢測限,進(jìn)樣濃度:0.001 μg/mL,最低檢測限 =0.001 μg/mL ×20 μL=2 ×10-5μg。
2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 利用最低檢測限下配置的50 μg/mL聯(lián)苯芐唑?qū)φ掌罚眉状贾鸩较♂屌渲瞥?1、5、10、25、40 μg/mL 的溶液。每一濃度進(jìn)樣2次進(jìn)行測定。以對照品的峰面積(A)對濃度(C)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程A=38.541 C+7.075 3(r=0.999 9)。結(jié)果,聯(lián)苯芐唑檢測濃度的線性范圍為1~40 μg/mL。濃度大于該范圍的樣品用接收介質(zhì)稀釋后,進(jìn)樣測定。
2.6 回收率試驗(yàn) 用甲醇稀釋配制 5、25、50 μg/mL聯(lián)苯芐唑溶液,每種濃度分別配3份,按色譜條件每種濃度連續(xù)進(jìn)樣3次,用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藥量,計(jì)算回收率,回收率在98% ~102%之間,見表1。
表1 回收率測定結(jié)果(n=9)
2.7 精密度試驗(yàn) 回收率測定所用樣品溶液,每種濃度測定3次,計(jì)算高、中、低不同濃度的精密度,結(jié)果見表2。結(jié)果顯示精密度良好。
表2 精密度測定結(jié)果
2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取聯(lián)苯芐唑試驗(yàn)樣品溶液(50.1 μg),于室溫下放置,并于 0、2、3、4、5 h 按以上色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示,聯(lián)苯芐唑峰面積無明顯變化,表明樣品溶液在5 h內(nèi)基本穩(wěn)定。見表3。
表3 樣品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果
2.9 體外經(jīng)皮擴(kuò)散試驗(yàn)
2.9.1 接受介質(zhì)的確定 在體外經(jīng)皮試驗(yàn)中,文獻(xiàn)中最常用的接受液是生理鹽水和磷酸鹽緩沖液(PBS),理想的接受介質(zhì)應(yīng)當(dāng)可以準(zhǔn)確模擬被測化合物的體內(nèi)經(jīng)皮吸收條件。一般來說,在接受液中,藥物的濃度不能超過其飽和溶解度的10%(即應(yīng)該滿足漏槽條件),接受液濃度過高能導(dǎo)致吸收速率降低,進(jìn)而導(dǎo)致過低估計(jì)了其在體吸收。一般認(rèn)為,一個(gè)化合物在某水性溶液中的溶解度如果低于10 μg/mL,則不能用該溶液做接受液,有必要在接受介質(zhì)中加入增溶劑[14]。
因?yàn)槁?lián)苯芐唑是難溶性藥物,因此,我們首先考察藥物在生理鹽水、丙二醇∶生理鹽水(1∶2)以及PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液中的溶解度,以確定接受介質(zhì)。
稱取聯(lián)苯芐唑原料藥約1 g,至30 mL磨口三角瓶中,加入接受液25 mL,使溶液中始終保持有固體藥物存在,將此溶液置于37℃恒溫水浴中,100 rpm磁力攪拌,定時(shí)取樣1 mL,0.45 μm微孔濾膜濾過,棄去初濾液,取續(xù)濾液,進(jìn)樣20 μL用HPLC測定含量,按標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算聯(lián)苯芐唑的濃度,超過標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍的樣品,用各自接受介質(zhì)稀釋后進(jìn)樣測定。每種介質(zhì)平行做2份試驗(yàn)。分別測定3、5、10 h的溶解度,以確定所選的介質(zhì)是否可以滿足漏槽條件。聯(lián)苯芐唑在PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液中溶解度稀釋20倍后進(jìn)樣測定。見表4。
表4 聯(lián)苯芐唑在生理鹽水及丙二醇∶生理鹽水(1∶2)、PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液中溶解度(37℃,μg/mL)
由表4可見,聯(lián)苯芐唑在丙二醇∶生理鹽水(1∶2)混合液中溶解度約為2 μg/mL;在生理鹽水中的溶解度約為1 μg/mL;在PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液中約為 400 μg/mL(>10 μg/mL)。由于聯(lián)苯芐唑在丙二醇∶生理鹽水(1∶2)混合液中溶解度很低,不符合漏槽條件,筆者選用生理鹽水和PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液作為透皮吸收的接受液,分別考察藥物的經(jīng)皮透過性。
2.9.2 透皮試驗(yàn) 采用改良的Franz立式擴(kuò)散池進(jìn)行試驗(yàn),本法是目前文獻(xiàn)中較常見的局部用制劑的體外透過性研究方法,一般認(rèn)為是一種簡單、重現(xiàn)性好的試驗(yàn)方法[2]。
擴(kuò)散池由給藥池和接收池組成,將皮膚固定在供給池與接收池之間,將角質(zhì)層面向給藥池一側(cè),供給池中加入被測制劑(聯(lián)苯芐唑乳膏0.5 g),輕輕涂抹,使乳劑均勻分布于皮膚上。接收池中加入7 mL的接受液,供給池底部凹槽中放入磁力攪拌子,攪拌速度100 rpm,溫度(37±0.5)℃。開始試驗(yàn)后,于1、2、3、4、6、8、10 h 定時(shí)取樣,每次吸取2 mL接受液,隨即補(bǔ)等量的接受液,樣品溶液過濾后,利用HPLC測定藥物濃度。按分析方法項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,測得峰面積后,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度,再根據(jù)接受池液體積和有效擴(kuò)散面積,按下面的公式計(jì)算單位面積(cm2)的累積透皮量(Qn)。
式中,Ci為第i點(diǎn)測得的藥物濃度(μg/mL);V為接受池液的總體積(7.0 mL);Vi為每次取樣的體積(2.0 mL);S為滲透面積(3.14 cm2)。受試聯(lián)苯芐唑乳膏和對照聯(lián)苯芐唑乳膏(市售)分別以生理鹽水、PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液為接受液測定經(jīng)皮透過性。在生理鹽水接受液的條件下,對照聯(lián)苯芐唑乳膏樣品和受試樣品均不能透過離體的小型豬皮膚。在 PEG400∶生理鹽水(1∶2)接收液條件下有微量透過,試驗(yàn)結(jié)果見表5~表8;可以看出,10 h的累積透過量受試聯(lián)苯芐唑乳膏為(0.286±0.100)μg/cm2,對照聯(lián)苯芐唑乳膏為(0.269±0.033)μg/cm2;二者經(jīng)皮透過曲線基本一致,見圖4。所以,可以證明受試聯(lián)苯芐唑乳膏和對照聯(lián)苯芐唑乳膏在經(jīng)皮透過性上沒有差異。
表5 受試聯(lián)苯芐唑乳膏經(jīng)皮透過性測定結(jié)果[PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液為接受液,μg/mL]
表6 受試聯(lián)苯芐唑乳膏經(jīng)皮累積透過量[PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液為接受液,μg/cm2]
表7 對照聯(lián)苯芐唑乳膏經(jīng)皮透過性測定結(jié)果[PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液為接受液,μg/mL]
中國藥典2005年版用甲醇∶水∶四氫呋喃(體積比為84∶5∶1)作測定乳膏中聯(lián)苯芐唑的流動相,并規(guī)定了理論塔板數(shù)不得低于700。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)采用這一流動相測定時(shí),聯(lián)苯芐唑的最低檢測限0.01 μg(0.5 μg/mL ×20 μL),不夠靈敏且色譜峰變寬。因此,本文本試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[3-6],并經(jīng)試驗(yàn)確定,以pH7.0三乙胺磷酸鹽緩沖液∶乙腈∶甲醇(15∶17∶68)為流動相,采用ODSC18色譜柱,可有效減少ODS色譜柱硅醇基引起的藥物拖尾現(xiàn)象,而且測試時(shí)間相對較短。
表8 對照聯(lián)苯芐唑乳膏經(jīng)皮累積透過量[PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液為接受液,μg/cm2]
圖4 聯(lián)苯芐唑乳膏經(jīng)皮透過性測定曲線(PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液為接受液)
透皮實(shí)驗(yàn)中,接受介質(zhì)的確定是較關(guān)鍵的一步。在接受液中,藥物濃度應(yīng)滿足漏槽條件。由于聯(lián)苯芐唑是難溶藥物,本實(shí)驗(yàn)首先考察藥物在生理鹽水、丙二醇∶生理鹽水(1∶2)以及PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液中的溶解度,以確定接受介質(zhì)。實(shí)驗(yàn)時(shí),注意使溶液中始終保持有固體藥物存在,即確保溶液達(dá)到飽和狀態(tài)。溶解度大的介質(zhì)(PEG400∶生理鹽水(1∶2)混合液)可以滿足漏槽條件;雖然聯(lián)苯芐唑在生理鹽水中的溶解度很低,只有1 μg/mL左右,但是在透過性試驗(yàn)中證明并沒有藥物透過,所以也符合漏槽條件,而且生理鹽水中因?yàn)闆]有添加外來物質(zhì),更能代表在體的真實(shí)情況,因此,選擇這兩種介質(zhì)合理可行。
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