許 英，陳建華，欒明寶，王曉飛，孫志民

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類(lèi)研究所，湖南 長(zhǎng)沙410205）

苧麻（Boehmeria nivea（L.）Gaud.）屬于蕁麻科（Urticaceae）苧麻屬（Boehmeria），素有“中國(guó)草”之稱(chēng)。根據(jù)瓦維洛夫的觀點(diǎn)，苧麻起源于中國(guó)的中部和西部[1]。中國(guó)是世界上苧麻種植歷史最久、種植面積最大的國(guó)家。苧麻種質(zhì)資源是育種、科研、教學(xué)及生產(chǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)，歷年來(lái)采用田間種植集中保存，這種保存方式難以切斷各種質(zhì)間病害的傳播和有效地抵御自然災(zāi)害。如國(guó)家種質(zhì)苧麻圃1963年的苧麻青枯病害，資源全部感染，最后焚燒重新建圃；1996年的沅江洪水災(zāi)害，圃中1000多份種質(zhì)丟失[2]。為了安全、穩(wěn)定地保存種質(zhì)，對(duì)苧麻資源的保存方式進(jìn)行創(chuàng)新顯得非常必要。超低溫保存能夠減少植物間病毒傳播，抵御外界自然環(huán)境變化的影響，而且植物材料的代謝和生長(zhǎng)活動(dòng)在液氮液相（-196℃）或液氮霧相（-150℃）的超低溫條件下幾乎停止，植物材料處于相對(duì)穩(wěn)定的生物學(xué)狀態(tài)，能夠有效保持材料的遺傳穩(wěn)定性，同時(shí)又不會(huì)喪失其形態(tài)發(fā)生的潛能，理論上能夠無(wú)限期地保存植物材料[3-10]。迄今為止在國(guó)內(nèi)外進(jìn)行過(guò)超低溫保存的植物材料已達(dá)200多種，有谷類(lèi)、豆類(lèi)、薯類(lèi)、花卉等[11-16]，本試驗(yàn)以苧麻近緣野生種微綠苧麻為研究材料，通過(guò)PVS2保護(hù)試劑玻璃化包埋，進(jìn)行超低溫保存技術(shù)研究，目的為苧麻種質(zhì)資源保存方式創(chuàng)新提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為從廣西那坡縣定業(yè)鄉(xiāng)征集的苧麻近緣野生種微綠苧麻，它種植于國(guó)家種質(zhì)苧麻圃。從圃中取材消毒，進(jìn)行無(wú)性繁殖培養(yǎng)，得到組培苗。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件

組織培養(yǎng)溫度控制在26℃左右，光照強(qiáng)度為1500Lux左右，每天光照時(shí)間14h。超低溫保存之后，先暗培養(yǎng)3-7天。

1.2.2 培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)

根據(jù)以前報(bào)道的苧麻組織培養(yǎng)研究結(jié)果和筆者多年苧麻組織培養(yǎng)實(shí)踐[17]，發(fā)現(xiàn)改良后的MS培養(yǎng)基即1/2MS培養(yǎng)基最適合苧麻的外值體生長(zhǎng)，故本研究中的基本培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基，通過(guò)添加不同種類(lèi)和濃度的激素來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基，對(duì)“微綠苧麻”外植體進(jìn)行快繁，每天對(duì)外植體生長(zhǎng)情況進(jìn)行記載、對(duì)比及分析，以此篩選合適的培養(yǎng)基。

1.2.3 玻璃化超低溫保存流程

微綠苧麻玻璃化超低溫保存的流程為：預(yù)培養(yǎng)、裝載、冷凍、解凍、TTC檢測(cè)、恢復(fù)培養(yǎng)。玻璃化超低溫保存具體操作如下：將微綠苧麻的腋芽和莖尖分別置于添加了30～60g/L的蔗糖含量的1/2MS+6BA（0.5mg/l）和1/2MS+6BA（1.0mg/l）的培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)1-4天；超凈工作臺(tái)上，取外植體置入2 mL冷凍管中，用1/2MS+0.4 mol/L蔗糖+2 mol/L甘油溶液裝載，轉(zhuǎn)入冰凍保護(hù)劑PVS2中（30%甘油+15%乙二醇+1 5%D MS O+0.4 mol/L蔗糖），置入程序降溫盒（每分鐘降1℃），在-80℃的超低溫冰箱中預(yù)冷，再放于-196℃的液氮中進(jìn)行保存，保存1-2天之后，立即置于40℃的水浴鍋中進(jìn)行快速化凍；吸去PVS2保護(hù)試劑溶液，經(jīng)過(guò)消毒的1/2MS液體培養(yǎng)基洗滌3-4次，置于篩選好的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)活培養(yǎng)和TTC細(xì)胞活力檢測(cè)。

1.2.4 細(xì)胞活力檢測(cè)

超低溫保存后的微綠苧麻外植體采用氯化三苯四氮唑（TTC）法檢測(cè)活力[18]，它的試劑配比是1%氯化三苯四氮唑：0.4mol/L琥珀酸鈉：pH7.0的0.1mol/L磷酸緩沖液=1：5：4。取冷凍洗滌后的苧麻外植體，濾紙吸去水分，加入TTC試劑，在黑暗下于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時(shí)后，吸去TTC溶液，用蒸餾水洗滌3次。在解剖顯微鏡下觀察，計(jì)算染色率。

2 結(jié)果與分析

2.1 微綠苧麻的組織培養(yǎng)研究

取微綠苧麻組培苗的腋芽和莖尖，以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，通過(guò)添加不同的激素進(jìn)行培養(yǎng)，得到莖尖或腋芽直接生長(zhǎng)的苗，每個(gè)配比都為50個(gè)外植體，三次重復(fù)。經(jīng)過(guò)大量的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在僅添加6BA的情況下，兩個(gè)外植體的出苗率最高。然后對(duì)添加不同含量的6BA進(jìn)行比較研究，結(jié)果見(jiàn)表1。從表中可見(jiàn)，微綠苧麻在6BA為0.5mg/l的激素配比下腋芽的出苗率最高，達(dá)到94.7%，在6BA為1.0mg/l的激素配比下莖尖的出苗率最高達(dá)到75.10%。在外植體獲得方面，腋芽的操作相對(duì)于比較簡(jiǎn)單，而莖尖需要借助解剖鏡才能獲得，操作比較復(fù)雜；在出苗率方面，腋芽的成苗能力強(qiáng)于莖尖，腋芽增殖的苗為叢生苗，莖尖成苗為單株，并且莖尖在直接成苗的過(guò)程中容易長(zhǎng)愈傷。

2.2 不同的裝載時(shí)間和PVS2處理時(shí)間對(duì)微綠苧麻超低溫保存的影響

表1 在6BA影響下腋芽和莖尖的出苗百分率情況Table 1 The effect of6BAon propagations ofaxillarybuds and shoot tips

在植物超低溫保存研究過(guò)程中，通常玻璃化溶液（PVS）快速脫水之前，有一個(gè)所謂裝載（1oading）的過(guò)程，即用一個(gè)較高濃度的混合液于室溫下預(yù)處理一定時(shí)間，進(jìn)一步降低植物組織含水量，避免由于滲透壓變化劇烈對(duì)研究材料造成的傷害。本試驗(yàn)采用研究者常用的1/2MS+0.4mol/L蔗糖+2 mol/L甘油溶液為裝載液體，以腋芽為研究的外植體，采用了0min，10min，20min，30min，40min5個(gè)時(shí)間段進(jìn)行比較研究，從圖1中結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)裝載20min時(shí)成活率明顯高于其它裝載時(shí)間。裝載之后的外植體添加PVS2保護(hù)劑，進(jìn)一步脫去水份，PVS2保護(hù)劑緩慢的滲透到植物的組織中，當(dāng)外植體表現(xiàn)為玻璃化狀態(tài)的時(shí)候，在液氮中可以有效的保護(hù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，但是由于保護(hù)劑中含有劇毒的二甲基亞砜，如果處理時(shí)間太久會(huì)使外植體中毒或產(chǎn)生變異，處理時(shí)間太短難以有效的保護(hù)外植體免受凍傷。在本實(shí)驗(yàn)中采用了5個(gè)不同的時(shí)間對(duì)外植體進(jìn)行了處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在處理10分鐘后，TTC檢查的成活率最高，隨著處理的時(shí)間增加成活率急劇下降，在30分鐘的時(shí)候成活率只有1.06%。

2.3 不同預(yù)處理時(shí)間和蔗糖含量對(duì)超低溫保存后成活率的影響

圖1 不同的裝載時(shí)間對(duì)微綠苧麻超低溫保存的影響Fig.1 Effects of different loading time on the survival rate after cryopreservation

圖2 不同的PVS2溶液處理時(shí)間對(duì)微綠苧麻超低溫保存的影響Fig.2 Effects of different treating time with PVS2on the survival rate after cryopreservation

在使用1/2MS+0.4mol/L蔗糖+2mol/L甘油裝載20min，添加PVS2處理10min后，梯度降溫到-70℃，轉(zhuǎn)入液氮中保存。具體結(jié)果見(jiàn)表2。從表2中可以發(fā)現(xiàn)在蔗糖含量和預(yù)培養(yǎng)時(shí)間兩種因素的影響下，腋芽在培養(yǎng)基中蔗糖含量為40g/L，預(yù)培養(yǎng)2天的狀態(tài)下TTC檢測(cè)成活率最高為48.67%。莖尖在培養(yǎng)基中蔗糖含量為50g/L，預(yù)培養(yǎng)2天的成活率最高為21.38%。

2.4 超低溫保存后恢復(fù)性培養(yǎng)研究

表2 不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間和蔗糖含量對(duì)微綠苧麻超低溫保存成活率的影響Table 2 Effect of different preculture time and different contents of sucrose in culture medium on the survival rate after cryopreservation

超低溫保存后從液氮中取出后，在40℃水浴鍋中迅速解凍2分鐘，再用1/2MS液體培養(yǎng)基清洗3次，吸干水置于篩選好的1/2MS培養(yǎng)基（見(jiàn)2.1）中，置于26℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)3-7天，取出置于人工培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。通過(guò)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，開(kāi)始的時(shí)候外植體部分變褐，10天左右慢慢的變綠，直接長(zhǎng)苗；有些變黃軟化失去活力。目前為止，獲得完整的恢復(fù)苗11株，并且全部為腋芽生長(zhǎng)出來(lái)的。

3 討 論

從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，腋芽和莖尖兩種外植體經(jīng)過(guò)玻璃化超低溫保存之后，都可以通過(guò)TTC檢測(cè)到活力。在其它植物超低溫試驗(yàn)中，試管苗的莖尖作為超低溫保存的外植體比其它器官或組織具有易于再生、脫水損傷小等優(yōu)勢(shì)。但是從本試驗(yàn)中的結(jié)果可以看出，增殖培養(yǎng)的時(shí)候腋芽出苗率最高達(dá)94.7%，莖尖出苗率為75.10%，腋芽出苗率明顯高于莖尖出苗率，經(jīng)過(guò)超低溫保存之后的TTC檢測(cè)成活率腋芽同樣優(yōu)于莖尖，在超低溫保存后，恢復(fù)培養(yǎng)的時(shí)候只有腋芽得到苗，筆者認(rèn)為對(duì)于微綠苧麻采用腋芽作為超低溫保存的材料最適合，并且在菊花、柿和君遷子的超低溫保存中有同樣的情況[19]。

適應(yīng)微綠苧麻外植體的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為2天，預(yù)培養(yǎng)蔗糖的含量腋芽為40g/L，莖尖為50g/L，裝載的時(shí)間為20min，PVS2處理的時(shí)間為10min。在其最佳配比之下腋芽的TTC檢測(cè)活力最高達(dá)到了48.67%，莖尖達(dá)到了21.38%，在恢復(fù)培養(yǎng)試驗(yàn)中只有腋芽生長(zhǎng)出了11株苗。通過(guò)分析和查閱資料，筆者認(rèn)為有可能和微綠苧麻這種植物不耐漬和酚類(lèi)物質(zhì)含量高易氧化有關(guān)，盡管在PVS2保護(hù)劑中加入了PVP來(lái)防止氧化，但是在恢復(fù)培養(yǎng)的過(guò)程還是慢慢的褐化?；謴?fù)生長(zhǎng)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，并不是TTC檢測(cè)出有多少活力它就生長(zhǎng)出多少苗，它只是個(gè)初步評(píng)價(jià)，僅表現(xiàn)為超低溫保存后被檢測(cè)出有活力的外植體有可能長(zhǎng)出苗，沒(méi)有活力的一定不能夠生存。

迄今為止，超低溫保存被科學(xué)家認(rèn)為是無(wú)性繁殖植物長(zhǎng)期保存的理想方法，它的原理是植物材料的代謝和生長(zhǎng)活動(dòng)在液氮液相（-196℃）或液氮霧相（-150°C）的超低溫條件下幾乎停止，植物材料處于相對(duì)穩(wěn)定的生物學(xué)狀態(tài)，因此能夠有效保持材料的遺傳穩(wěn)定性，同時(shí)又不會(huì)喪失其形態(tài)發(fā)生的潛能，理論上能夠無(wú)限期地保存植物材料。它屬于室內(nèi)保存技術(shù)，相對(duì)于田間保存需要的空間比較小，勞動(dòng)力強(qiáng)度小，使用方便，不受外界環(huán)境條件的影響，并且可以隔離各個(gè)種之間的病毒傳播。盡管在此研究中獲得了TTC檢測(cè)活力最高達(dá)到48.67%，恢復(fù)培養(yǎng)中獲得了11株苗，離實(shí)際的應(yīng)用要求還有很大的距離，筆者覺(jué)得作為無(wú)性繁殖的植物苧麻來(lái)說(shuō)超低溫保存的研究和應(yīng)用意義重大，下一步將更加深入的對(duì)苧麻超低溫保存進(jìn)行研究，特別是恢復(fù)培養(yǎng)的方法，提高出苗率。

[1] 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類(lèi)研究所.中國(guó)苧麻品種志[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1992：2-3.

[2] 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類(lèi)研究所.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類(lèi)研究所所志（1958-1997）[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社，2008.

[3] 盧新雄，等.農(nóng)作物種質(zhì)資源保存技術(shù)規(guī)程[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社.2008.

[4] 劉麗芳，等.甘薯種質(zhì)超低溫保存研究進(jìn)展[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào).2009，10（2）：324-327.

[5] 苗琦，谷運(yùn)紅，等.植物組織培養(yǎng)物的超低溫保存[J].植物生理學(xué)通訊.2005，41（3）：350-354.

[6] Engelmann F.Plant cryopreservation：progress and prospects.In VitroCellular&Developmental[J].Biologyof Plant，2004，409（5）：427-433.

[7] Mitsuteru S，Pramod T，Masaya I，Takayuki T.Development of a new vitrification solution，VSL，and its application to the cryopreservation ofgentian axillarybuds[J].Plant Biotechnol Rep，2008（2）：123-131.

[8]Leena Ryyn?nen，Tuija Aronen.Verifications，a complementarycryopreservation method for Betula pendula Roth[J].Cryobiology，2005（51）：208-219.

[9] 陳珊.花粉超低溫保存的研究和應(yīng)用進(jìn)展[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，13（7）：39-40.

[10] 王培忠，裴崎君，等.植物種質(zhì)資源超低溫保存原理與研究進(jìn)展[J].吉林農(nóng)業(yè)科技，2007，36（4）：17-20.

[11] 李廣武，鄭從藝，唐兵.低溫生物學(xué)[M].長(zhǎng)沙：湖南科技出版社.1998：289-295.

[12] 陳輝，陳曉玲，等.切花百合離體莖尖玻璃化法超低溫保存研究[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào).2007，8（2）：170-173.

[13] 石思信，曹心如.草莓叢生芽超低溫（-196℃）保存[J].園藝學(xué)報(bào).1992，19（1）：83-84.

[14] 劉劍鋒，閻秀峰，等.高山紅景天愈傷組織的超低溫保存[J].林業(yè)科學(xué).2007，43（6）：57-60.

[15] 張演義，孫仲序等.超低溫保存果樹(shù)種質(zhì)資源研究進(jìn)展.山東林業(yè)科技.2002，138（1）45-47

[16] 劉亞軍，高麗萍，等.茶懸浮培養(yǎng)細(xì)胞玻璃化超低溫保存研究[J].茶葉科學(xué)，2009，29（2）：120-126.

[17] 許英，陳建華，等.中苧1號(hào)組織培養(yǎng)及無(wú)性快繁的研究[J].中國(guó)麻業(yè)科學(xué)，2010，32（2）：89-93.

[18] http：//bbs.biogo.net/simple/t154131.html

[19] 劉艷霞，劉杜長(zhǎng)，等.菊花莖尖的玻璃化超低溫保存研究[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2009，10（2）：249-254.