單廣夷，孔垂?jié)?，李軍，張哲，陳啟?/p>

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，沈陽(yáng) 110001）

膀胱癌是泌尿外科常見的惡性腫瘤，手術(shù)切除是其常規(guī)治療方法，但手術(shù)對(duì)于晚期腫瘤效果不良，所以藥物輔助治療被寄予厚望。雷帕霉素（rapamycin，RAPA），又名西羅莫司（sirolimus），分子式C51H79NO13，分子量 914 200。它具有免疫抑制作用［1］，同時(shí)還能夠抑制血管平滑肌增殖，可通過阻止平滑肌細(xì)胞增生和遷移而減少再狹窄。近年來的研究證明，雷帕霉素可以抑制如肝癌、胰腺癌、膀胱癌等［2~4］多種腫瘤的生長(zhǎng)，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖［5］、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［6］、抑制侵襲［7］、抑制腫瘤血管生成［8］等多種作用。其腫瘤抑制作用的主要靶點(diǎn)為哺乳類動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）［9］。本研究為揭示雷帕霉素對(duì)膀胱癌的作用，探討了雷帕霉素對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞系增殖及侵襲的影響，并初步判斷mTOR是否在T24細(xì)胞中存在表達(dá)，旨在進(jìn)一步探明雷帕霉素對(duì)膀胱腫瘤影響的可能通路。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

雷帕霉素（美國(guó)LC公司）；膀胱癌T24細(xì)胞系（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）；MTT（美國(guó)Sigma公司）；transwell板（美國(guó) Corning公司）；matrigel基底膜膠（美國(guó)BD公司）；酶標(biāo)儀（國(guó)產(chǎn)）；倒置顯微鏡（Olympus，日本）；RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibical公司）；胎牛血清（天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)：T24細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。雷帕霉素溶于無水乙醇，－20℃保存，使用時(shí)用RPMI 1640稀釋至需要濃度。將細(xì)胞隨機(jī)分為：（1）處理組：接種細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，按不同檢測(cè)項(xiàng)目加入雷帕霉素；（2）對(duì)照組：不加入雷帕霉素。每天換液。

1.2.2 腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率檢測(cè)：采用MTT比色法。T24細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，接種于96孔板，每孔加100μL細(xì)胞懸液（含105個(gè)細(xì)胞），貼壁培養(yǎng)24 h后，再加入100μL培養(yǎng)液，使雷帕霉素終濃度為10~1 000 nmol/L，每孔設(shè)4個(gè)復(fù)孔并設(shè)對(duì)照孔（加細(xì)胞不加藥物）和凋零孔（加培養(yǎng)液不加細(xì)胞），培養(yǎng)24 h、48 h和 72 h后，每孔加 MTT（5 mg/mL）20 μL，再培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液。每孔加DMSO 150μL，避光振蕩混勻，結(jié)晶溶解后用酶標(biāo)儀測(cè)波長(zhǎng)490 nm的吸光度值（OD 值）。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（IR）=（1－實(shí)驗(yàn)孔OD值/對(duì)照孔OD值）×100%。

1.2.3 體外侵襲實(shí)驗(yàn)：將matrigel用RPMI-1640培養(yǎng)液按1︰5比例稀釋后，每孔35μL均勻地鋪在聚碳酸酯膜上（24孔板，8μm孔徑），37℃孵育4 h。待成膠后，消化細(xì)胞，用含5%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮，每孔加入200μl密度為4×105/mL的細(xì)胞懸液，并在小室內(nèi)加入雷帕霉素，調(diào)終濃度至50~200 nmol/L。聚碳酸酯膜下層加入600μL含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。將膜用PBS洗2次，甲醇固定15 min，洗2次，加入結(jié)晶紫（0.1%）染色，室溫30 min，PBS洗2次，擦去matrigel膠。隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察，計(jì)數(shù)每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，取平均數(shù)，重復(fù)3次。侵襲抑制率=（1－實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞平均數(shù)/對(duì)照組穿膜細(xì)胞平均數(shù)）×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

全部數(shù)據(jù)以x±s表示，應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率

不同濃度的雷帕霉素作用T24細(xì)胞24 h、48 h、72 h后，隨著藥物濃度的增高和時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)T24細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，且呈時(shí)間和濃度依賴性，當(dāng)1 000 nmol/L雷帕霉素作用72 h時(shí)，生長(zhǎng)抑制率達(dá)（54.28±2.42）%，IC50為 199.53 nmol/L，各時(shí)間組與濃度組之間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），見表 1，圖 1。

表1 雷帕霉素干預(yù)T24后細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%，x±s）Tab.1 The inhibition rate of rapamycin on T24 cells（%，x±s）

圖1 MTT法檢測(cè)雷帕霉素干預(yù)對(duì)T24細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of rapamycin on the growth of T24 cells assessed by MTT assay

2.2 細(xì)胞侵襲能力

小室侵襲實(shí)驗(yàn)表明，雷帕霉素處理組的細(xì)胞數(shù)低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨著雷帕霉素濃度的升高，T24細(xì)胞的侵襲能力下降（P＜0.05），提示雷帕霉素抑制了腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。與對(duì)照組相比，200 nmol/L組浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)下降了31.8%。見表2，圖2。

3 討論

膀胱癌的治療方法主要為手術(shù)、膀胱灌注、化療、放療等?，F(xiàn)有的膀胱灌注及全身化療藥物，雖有一定效果，但毒副作用較大，因此臨床急需一種毒副作用較小、且有一定治療效果的新藥。雷帕霉素是mTOR的特異性抑制藥物，具有抑制腫瘤生長(zhǎng)，減少腫瘤淋巴管形成，抑制腫瘤血管內(nèi)皮生長(zhǎng)等多種抗腫瘤作用。mTOR為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于PIKK（Ptdlns3K-related kinase family）家族成員之一［10］，可協(xié)調(diào)蛋白質(zhì)的生物合成和降解。本研究通過檢測(cè)雷帕霉素對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞的作用，間接證明了mTOR在T24細(xì)胞中的存在。

表2 雷帕霉素對(duì)T24細(xì)胞侵襲能力的影響Tab.2 Effect of Rapamycin on T24 cell invasion

圖2 雷帕霉素干預(yù)后穿膜細(xì)胞情況 ×200Fig.2 Transwell chamber assay results of T24 cells×200

腫瘤的惡性程度體現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。增殖是腫瘤細(xì)胞的基本特性，當(dāng)細(xì)胞因?yàn)橥蛔兌鴨适?duì)分裂的調(diào)控時(shí)，就會(huì)成倍增殖形成腫瘤，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖是抗腫瘤藥物的基本要求。本研究中，MTT結(jié)果顯示，雷帕霉素對(duì)T24細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，且呈現(xiàn)量效－時(shí)效的關(guān)系，即隨著雷帕霉素濃度的升高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，T24細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率逐漸升高。侵襲是指腫瘤細(xì)胞穿過血管壁，克隆增殖的過程。抑制腫瘤的侵襲能力也是控制腫瘤轉(zhuǎn)移的一種途徑。本研究通過transwell的方法檢測(cè)了雷帕霉素對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞侵襲能力的影響。在藥物濃度的選擇上，通過IC50計(jì)算及分析，最終確定選擇對(duì)細(xì)胞生存影響較小的50~200 nmol/L濃度區(qū)間進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)，并選擇24 h的侵襲時(shí)間，以防止細(xì)胞穿膜后的增殖影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。研究結(jié)果顯示，雷帕霉素能夠抑制T24細(xì)胞的侵襲，處理組與對(duì)照組相比，穿過基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且抑制作用呈劑量依賴性。

綜上所述，雷帕霉素是一種很有潛力的抗腫瘤藥物，通過對(duì)其通路的深入研究，有望尋找到更加容易調(diào)控的靶點(diǎn)，這將是未來進(jìn)一步深入研究的重點(diǎn)。

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