喬寵，常瑞晶，王春輝

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽(yáng) 110004；2.中國(guó)人民解放軍沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院肝膽外科，沈陽(yáng) 110016）

坍塌反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白1（collapsin response mediator protein-1，CRMP-1），也命名為二氫嘧啶酶/蛋白水解酶相關(guān)蛋白1（dihydropyrimidinase related protein-1，DRP-1 or dihydropyrimidinase-like1，DPYSL1），是坍塌反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白（collapsin response mediator protein，CRMP）家族成員之一，在神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)最高，尤其是胚胎發(fā)育期，參與軸突引導(dǎo)、核苷堿基、核苷類、核苷酸和核酸代謝。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)該蛋白參與突起生長(zhǎng)、細(xì)胞變形和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移等過(guò)程［1］，本研究擬構(gòu)建該基因的表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究該蛋白在腫瘤轉(zhuǎn)移中的生物學(xué)作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

E.coli Competent cell DH5a和p3x-FLAG-myc-CMV-24表達(dá)載體由中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)微尺度實(shí)驗(yàn)室孫斐教授提供；200DNA ladder marker，HindⅢ，SalⅠ限制性內(nèi)切酶，連接酶solutionⅠ以及一步PCR法試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；PCR純化試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自Axygen公司。細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、FBS、PBS購(gòu)自Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 CRMP1-p3x-FLAG-myc-CMV-24克隆載體構(gòu)建：從CRMP-1（GenBank序列號(hào)NM_001313；NP 001014809）基因的完整閱讀框（open reading frame，ORF）序列的兩端設(shè)計(jì)引物，上游引物為5′GGTCAAGCTTATGCGTACCAGGGCAAGA3′，下游引物為 5′ATGTCGACTCAACCGAGGCTGGTGATGTTG3′，引物中包含起始密碼子和終止密碼子，擴(kuò)增目的基因片段長(zhǎng)度為1 737 bp。將未經(jīng)過(guò)任何處理，且正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的10×106293T細(xì)胞按照Trizol法提取RNA，根據(jù)說(shuō)明書(shū)操作，提取的RNA-80℃保存。依照RT-PCR反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)，50μL體系PCR。反應(yīng)條件變性50℃30 min，退火94℃2 min反轉(zhuǎn)錄cDNA，按94℃ 30 min，60℃ 30 s，72℃ 2 min共 30個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物用DNA回收試劑盒回收、純化?；厥债a(chǎn)物30μL。將帶有酶切位點(diǎn)的目的片段CRMP-1與之所要連接的載體p3x-FLAG-myc-CMV-24進(jìn)行雙酶切，限制性內(nèi)切酶為HindⅢ和SalⅠ。37℃培養(yǎng)箱5h。用連接酶solutionⅠ，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，16℃1 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到制備的感受態(tài)E.coli中，涂布在含有100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，將平板放入37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。

1.2.2 鑒定：（1）提取質(zhì)粒及酶切鑒定：在平板上挑取4個(gè)單克隆點(diǎn)，接種于含有100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，250 r/min搖菌過(guò)夜，離心收集菌液，使用Axygen公司質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，顯示4個(gè)克隆點(diǎn)均連接上目的片段，然后用HindⅢ和SalⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，顯示前3個(gè)泳道切出目的條帶，第4個(gè)泳道為構(gòu)建錯(cuò)誤的片段，為進(jìn)一步驗(yàn)證所構(gòu)建載體的正確性，將前3個(gè)點(diǎn)所搖出的菌液送去測(cè)序；（2）測(cè)序：將酶切驗(yàn)證正確的陽(yáng)性克隆點(diǎn)搖菌37℃過(guò)夜，送菌液至英俊測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果

從293T細(xì)胞中提取的總RNA可見(jiàn)3條帶（圖1），分別是 28 s，18 s，5 s，未見(jiàn)其余條帶，在轉(zhuǎn)化后，將挑取的單克隆點(diǎn)提取質(zhì)粒，如圖2，根據(jù)其大小位置與空載體的對(duì)比，證明基因片段已經(jīng)連接上.重組表達(dá)質(zhì)粒p3x-FLAG-myc-CMV-24/CRMP-1雙酶切鑒定，圖3可見(jiàn)2條帶，一條為質(zhì)粒的長(zhǎng)度4.7 kb，目的片段1 737 bp，測(cè)序結(jié)果提示插入片段為目的片段，且進(jìn)行基因同一性比較為99.9%，氨基酸同一性比較為100%，并且插入方向正確（圖4）。

圖1 提取的293TRNA電泳圖Fig.1 Extraction of 293 TRNA electrophoresis diagram

3 討論

圖2 CRMP-1基因真核重組質(zhì)粒CRMP-1-p3x-FLAG-myc-CMV-24構(gòu)建Fig.2 Construction of the recombinant eukaryotic expression plazmid

圖3 質(zhì)粒酶切電泳圖Fig.3 Plasmid electrophoresis figure after restriction enzyme cutting

圖4 CRMP-1測(cè)序結(jié)果圖Fig.4 CRMP-1 sequencing results

CRMP屬于磷酸蛋白家族，最先在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，認(rèn)為其主要在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)［1］，特別是在胚胎生成時(shí)的神經(jīng)系統(tǒng)中［2］。目前研究一致認(rèn)為，CRMP參與神經(jīng)突突起生長(zhǎng)并引導(dǎo)其生長(zhǎng)方向［3］。CRMP家族有5個(gè)同源性胞質(zhì)蛋白，生理上參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，分別是 CRMP-1、CRMP-2、CRMP-3、CRMP-4和CRMP-5，最初的研究表明它們可參與神經(jīng)元分化和軸突引導(dǎo)，并且在這些成員中除CRMP-1之外的所有成員均有相互作用［4］。免疫細(xì)胞化學(xué)研究顯示：CRMP家族主要分布在生長(zhǎng)錐的板狀偽足和絲狀偽足，軸突及神經(jīng)體中，CRMP-1、CRMP-4、CRMP-5發(fā)現(xiàn)主要在小鼠胚胎腦組織中表達(dá)，但在成年小鼠腦組織中卻很少檢測(cè)到。

最近研究表明：CRMP在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中可抑制軸突延伸，參與微管動(dòng)力，延長(zhǎng)細(xì)胞周期［5］，并可在肺癌細(xì)胞浸潤(rùn)調(diào)節(jié)中形成一個(gè)類似的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)?？梢哉f(shuō)該家族蛋白能調(diào)節(jié)發(fā)育中的神經(jīng)細(xì)胞和血管系，使之幾乎可以浸潤(rùn)任何組織。所以這些抑制行為普遍存在［6］。Zhang等［2］在鼠的腦中，發(fā)現(xiàn)CRMP（CRMP1、CRMP2和CRMP4）經(jīng)過(guò)磷酸化方式進(jìn)行調(diào)節(jié)，通過(guò)磷酸化后產(chǎn)生生物學(xué)作用，這3個(gè)成員與嚴(yán)重外傷和神經(jīng)中毒相關(guān)，但是他們空間上和時(shí)間上的表達(dá)和磷酸化的分子機(jī)制仍不清楚。

CRMP-1是一個(gè)分子量為62 kDa的磷酸化蛋白?；蛭挥?號(hào)染色體上，全長(zhǎng)1 719 bp，由14個(gè)外顯子組成。是CRMP家族成員之一，首先在神經(jīng)細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，認(rèn)為是腦中特異性蛋白，參與在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中誘導(dǎo)生長(zhǎng)錐的衰亡［1，7］。通過(guò)原位雜交和免疫組化方法，發(fā)現(xiàn)CRMP-1在鼠胚胎小腦組織中高表達(dá)，最近幾年的研究發(fā)現(xiàn)該蛋白在嗅球、下丘腦和視網(wǎng)膜中均有表達(dá)。在細(xì)胞分裂間期，運(yùn)用熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)CRMP-1主要分布在胞質(zhì)，然而在某些細(xì)胞中CRMP-1既分布在胞質(zhì)也分布在胞核，同CRMP家族一樣，CRMP-1具體作用機(jī)制目前尚不清楚。

有關(guān)CRMP-1在神經(jīng)系統(tǒng)的生理作用主要有：（1）調(diào)節(jié)軸突引導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和神經(jīng)細(xì)胞遷移：可能通過(guò)Cdk5磷酸化CRMP-1來(lái)調(diào)節(jié)參與大腦皮層中壁板蛋白semaphorin3A引導(dǎo)的脊柱發(fā)育［7］。可通過(guò)調(diào)節(jié)Reln信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞遷移。并參與神經(jīng)元增殖、分化、遷移和軸突導(dǎo)向［8］，在微管動(dòng)力方面也起著重要的作用［9］。并可以感受到外界刺激引起神經(jīng)細(xì)胞衰亡，突觸萎縮及生長(zhǎng)錐瓦解，作為信息傳遞的重要調(diào)節(jié)者，對(duì)細(xì)胞骨架的聚合作用有極大的影響；（2）CRMP-1證明與叢狀蛋白依賴的神經(jīng)功能有關(guān)?？赡軈⑴c了在成年海馬神經(jīng)突起的生長(zhǎng)，有研究證明缺失CRMP-1可能會(huì)影響長(zhǎng)時(shí)程的增強(qiáng)和空間學(xué)習(xí)和記憶［10］。

起初人們認(rèn)為CRMP-1是在腦中是特異性的蛋白，但最近的研究表明人類CRMP-1基因表達(dá)水平可以影響腦外癌癥的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。CRMP-1蛋白水平和癌癥浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的程度成負(fù)相關(guān)，Goshima等人通過(guò)使用肺癌細(xì)胞系CL1–5轉(zhuǎn)染并過(guò)表達(dá)CRMP-1基因，通過(guò)形態(tài)學(xué)和體外浸潤(rùn)試驗(yàn)以及體內(nèi)試驗(yàn)，表明CRMP-1基因在癌細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到一定的作用，可能是一種抑制癌細(xì)胞基因［11］，所以目前將CRMP-1基因定義為抑制浸潤(rùn)基因。此后也有其他文獻(xiàn)報(bào)道，在CRMP家族中，只有CRMP-1有這種特殊的癌細(xì)胞抑制浸潤(rùn)作用。研究發(fā)現(xiàn)CRMP-1 參與大鼠泌乳素瘤的浸潤(rùn)［12］。Shih，Chu 等［1，13］研究，在肺腺癌患者中，低表達(dá)人CRMP-1基因的患者癌細(xì)胞浸潤(rùn)更深以及存在遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，高表達(dá)人CRMP-1基因的患者則發(fā)病間隔時(shí)間和生存期明顯延長(zhǎng)，Goshima，Chang 等［11，14］通過(guò)改良的細(xì)胞浸潤(rùn)試驗(yàn)以及動(dòng)物模型測(cè)轉(zhuǎn)移活力試驗(yàn)，表明CRMP-1可參與抑制人類肺腺癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)CRMP-1基因?qū)Ψ蜗侔┘?xì)胞的浸潤(rùn)作用可能通過(guò)NF-kappaBp50負(fù)反饋來(lái)調(diào)節(jié)［15］。

目前僅CRMP-2、CRMP-5研究較多，人CRMP-1蛋白研究也僅限于基礎(chǔ)研究，其結(jié)構(gòu)域的作用不清楚，活性部位沒(méi)有鑒定出。CRMP-1在遷移和浸潤(rùn)方面的作用，除了肺癌研究之外其他領(lǐng)域尚未涉及。我們構(gòu)建CRMP-1表達(dá)載體，為將來(lái)進(jìn)一步研究該基因在其他領(lǐng)域中，尤其是在產(chǎn)科方面及子癇前期方面的生物學(xué)作用及用于臨床診斷和治療方面奠定基礎(chǔ)。［致謝：本課題在選題及研究過(guò)程中特別感謝中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生殖生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室孫斐老師為我提供了良好的研究條件，姚桂東、尹貽蒙、王貴栓、劉琳、陰綿綿等在實(shí)驗(yàn)技術(shù)上的指導(dǎo)，謹(jǐn)向各位同仁表示誠(chéng)摯的敬意和謝忱。］

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