陳德金， 祝晨蔯， 林朝展， 趙鐘祥， 張翠仙

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣中尖峰天然產(chǎn)物共建實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510006)

裸花紫珠片為裸花紫珠Callicarpa nudifloraHook.et Arn;經(jīng)水提濃縮成膏后加輔料制成的薄膜衣片，具有消炎解毒、收斂止血之功效，用于治療呼吸道及消化道出血、細(xì)菌感染所引起的炎癥等［1］?，F(xiàn)行中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)中，裸花紫珠片的質(zhì)量是通過(guò)FeCl3試液鑒別酚羥基及NaNO2和Al(NO)3溶液鑒別黃酮的化學(xué)顯色反應(yīng)來(lái)控制的，這種方法極易出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)，缺乏專(zhuān)屬性。近年來(lái)，有文獻(xiàn)［2］報(bào)道用分光光度法測(cè)定了裸花紫珠片中總黃酮的含量，但該法存在靈敏度低、干擾因素多、專(zhuān)屬性較差等問(wèn)題，不利于對(duì)該產(chǎn)品進(jìn)行全面和有效的質(zhì)量控制。紫珠屬化學(xué)成分研究表明［3-7］，苯乙醇苷類(lèi)成分是該屬植物的主要成分類(lèi)群之一，本課題組自裸花紫珠甲醇提取物的正丁醇萃取部位中分離得到6個(gè)苯乙醇苷類(lèi)化合物，其中以毛蕊花糖苷及連翹酯苷含量最高?，F(xiàn)代藥理研究表明［8-10］，毛蕊花糖苷和連翹酯苷具有抗血栓、降血脂、抗氧化和調(diào)節(jié)非特異性免疫反應(yīng)等多方面的作用。為有效地控制裸花紫珠片的內(nèi)在質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法對(duì)裸花紫珠片中的毛蕊花糖苷及連翹酯苷的含量進(jìn)行測(cè)定，以期為該成藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)再提高提供理論依據(jù)。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 大連伊利特P230型液相色譜儀、EC2000色譜工作站;sartorius電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2 試藥 毛蕊花糖苷及連翹酯苷對(duì)照品為自制，經(jīng)歸一化法檢測(cè)，純度在98%以上;裸花紫珠片為市售品(海南九芝堂藥業(yè)有限公司，批號(hào):801530、801580、900850);D101型大孔吸附樹(shù)脂(天津南開(kāi)大學(xué)化工廠);液相所用甲醇為色譜純，水為超純水，其余所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇-0.1% 醋酸水溶液(40:60);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):334 nm;進(jìn)樣量:10 μL;理論塔板數(shù)按毛蕊花糖苷計(jì)算應(yīng)不低于10 000，按連翹酯苷計(jì)算應(yīng)不低于8 000;毛蕊花糖苷及連翹酯苷的保留時(shí)間分別為11.45 min和9.14 min，與其他組分分離良好。對(duì)照品和供試品的色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 供試品溶液的制備 取本品5片，除去糖衣，研細(xì)，取約0.25 g，精密稱(chēng)定，置圓底燒瓶中，加蒸餾水40 mL，加熱煎煮1 h，濾過(guò)，用適量蒸餾水洗滌燒瓶，洗液一并過(guò)濾，濾液置分液漏斗中，用適量蒸餾水洗滌濾器，洗液并入分液漏斗，依次用3倍量、2倍量、2倍量的水飽和正丁醇連續(xù)萃取3次，每次靜置至分層明顯，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)?～3 mL蒸餾水溶解，加于大孔樹(shù)脂柱(5 g，20 mm×150 mm，濕法裝柱)，先用100 mL蒸餾水洗脫，棄去水液，再用300 mL 50%甲醇-水洗脫，收集洗液，蒸干，殘?jiān)舆m量甲醇溶解并定容至10 mL，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

圖1 毛蕊花糖苷及連翹酯苷對(duì)照品(A)與供試品溶液(B)的高效液相色譜圖Fig.1 Chromatograms of control solution(A)and sample solution(B)

2.3 線性關(guān)系考察 精密稱(chēng)取對(duì)照品毛蕊花糖苷0.004 8 g、連翹酯苷0.005 4 g，置同一10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得混合對(duì)照品溶液。分別精密吸取混合對(duì)照品溶液 1、2、4、8、10、15、20 μL，依選定的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積(Y)對(duì)進(jìn)樣量(X)進(jìn)行線性回歸，回歸方程分別為:毛蕊花糖苷Y=1 233.6X－401.06，r=0.999 4，線性范圍0.48～9.6 μg;連翹酯苷Y=702.22X－ 208.82，r=0.999 7，線性范圍0.54 ～10.80 μg。

2.4 最低檢測(cè)限 在上述色譜條件下，按信噪比大于10/3時(shí)，對(duì)最低檢出限進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明毛蕊花糖苷與連翹酯苷的最低檢測(cè)限分別為0.96 ng、1.08 ng。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μL，依法連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積積分值，結(jié)果毛蕊花糖苷平均峰面積為6 569.58，RSD為1.29%;連翹酯苷的平均峰面積為3 851.23，RSD為0.66%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)的供試品，照2.2項(xiàng)下平行制備5份，依法測(cè)定，結(jié)果毛蕊花糖苷的平均含量為11.9 mg/片，RSD為2.44%;連翹酯苷的平均含量為10.3 mg/片，RSD為1.38%，表明分析方法的重現(xiàn)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別于0、1、2、4、8、12 h精密吸取同一供試品溶液10 μL，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果毛蕊花糖苷12 h內(nèi)的平均峰面積為6 560.30，RSD為1.21%;連翹酯苷的平均峰面積為3 826.56，RSD為1.69%，表明供試品溶液在室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量的供試品6份，分別精密加入一定量的毛蕊花糖苷及連翹酯苷對(duì)照品，照2.2項(xiàng)下制備回收率試驗(yàn)液，依法測(cè)定，并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

表1 毛蕊花糖苷回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 1 The recovery test of verbascoside

表2 連翹酯苷回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 2 The recovery test of forsythiaside

2.9 樣品測(cè)定 取3批樣品，照2.2項(xiàng)下制備供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)Table 3 The results of content assay for forsythiaside and verbascoside in Luohua Zizhu Tablets

3 討論

有關(guān)裸花紫珠片的質(zhì)量分析，僅有對(duì)其中總黃酮的含量測(cè)定，有關(guān)苯乙醇苷類(lèi)成分的研究尚未有研究報(bào)道。根據(jù)文獻(xiàn)［11-12］報(bào)道，筆者嘗試以熊果酸及齊墩果酸為指標(biāo)控制產(chǎn)品質(zhì)量，但供試品溶液中無(wú)法檢測(cè)出這兩個(gè)成分，提示萜類(lèi)化合物在本品中的含量極低。這可能是由于本品的水提制備工藝無(wú)法提出熊果酸等低極性成分造成的。然而，從本實(shí)驗(yàn)室對(duì)裸花紫珠、廣東紫珠、枇杷葉紫珠、全緣葉紫珠等多種紫珠屬植物的研究中發(fā)現(xiàn)，毛蕊花糖苷及連翹酯苷等苯乙醇苷類(lèi)化合物作為止血、抗炎、抗氧化的有效成分廣泛存在于紫珠屬植物中。因此，同時(shí)對(duì)毛蕊花糖苷及連翹酯苷這兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，建立以苯乙醇苷類(lèi)為裸花紫珠片的質(zhì)量控制體系，更能真實(shí)客觀地反映其內(nèi)在質(zhì)量。

通過(guò)對(duì)毛蕊花糖苷及連翹酯苷的紫外全波長(zhǎng)掃描，可知兩個(gè)對(duì)照品的紫外最大吸收均在334 nm。因此，本實(shí)驗(yàn)采用334 nm作為毛蕊花糖苷及連翹酯苷的檢測(cè)波長(zhǎng)，以保證兩個(gè)化合物在HPLC中有較高的響應(yīng)值及靈敏度。

本品水煎液成分復(fù)雜，分別用乙酸乙酯與正丁醇萃取后有交叉，不利于毛蕊花糖苷及連翹酯苷含量的準(zhǔn)確測(cè)定，因而選用正丁醇直接萃取。試驗(yàn)亦對(duì)水飽和正丁醇萃取次數(shù)及用量進(jìn)行了探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3倍量、2倍量、2倍量水飽和正丁醇連續(xù)萃取3次便能對(duì)毛蕊花糖苷及連翹酯苷萃取完全。

為降低測(cè)定時(shí)雜質(zhì)峰的干擾，試驗(yàn)選用大孔樹(shù)脂對(duì)毛蕊花糖苷及連翹酯苷進(jìn)行富集純化［13］。上柱采用的是20 mm×150 mm規(guī)格的小柱，大孔樹(shù)脂用量少(約5 g)，可以多次再生重復(fù)使用，有效節(jié)約了資源。同時(shí)也對(duì)大孔樹(shù)脂上樣量進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.25 g樣品粉末較為合適，0.5 g時(shí)已開(kāi)始出現(xiàn)超載現(xiàn)象。大孔樹(shù)脂上樣后，先用蒸餾水洗脫，洗脫液每10 mL一瓶，采用硫酸苯酚法［14-16］測(cè)定了其中多糖的含量，結(jié)果多糖主要集中在前50 mL洗液中，100 mL蒸餾水已基本將多糖洗脫完全。另外，還采用梯度洗脫的方法對(duì)洗脫液進(jìn)行了探討，結(jié)果30%甲醇水溶液未能洗下毛蕊花糖苷及連翹酯苷，而300 mL50%甲醇水溶液便可將其洗脫完全。

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