沈天豐,王 普

(1.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院,浙江 杭州 310032;2.浙江普洛家園藥業(yè)有限公司,浙江 東陽 322118)

S-腺苷-L-蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine,簡稱SAM)是一種廣泛存在于活體細胞內(nèi)的生物小分子,可由ATP:蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶(MAT)催化等分子的L-蛋氨酸和ATP合成得到[1].SAM是甲硫鍵型高能化合物,是生物體內(nèi)一種重要的生理活性物質(zhì)和中間代謝物質(zhì),具有轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)氨丙基和轉(zhuǎn)硫等多種生理生化功能.細胞內(nèi)SAM濃度的微小改變,便會對細胞的生長、分化和功能產(chǎn)生重大影響.

SAM在生物學(xué)上具有多種生理作用,主要用于抗抑郁[2-3]、肝病治療[4]、關(guān)節(jié)炎和偏頭痛治療[2],此外還具有食品營養(yǎng)強化劑等功能.SAM功能的多元性和無副作用,決定了其應(yīng)用的廣泛性和長期使用性.1999年美國FDA正式批準(zhǔn)上市后,SAM迅速成為暢銷的營養(yǎng)保健品之一,年銷售額超過十億美元.它在國際市場和國內(nèi)市場的需求不斷增長.近年來,國外的SAM臨床應(yīng)用已轉(zhuǎn)向?qū)Ω闻K疾患的治療.據(jù)報道,SAM 不僅利于各種急、慢性肝病的治療,而且對實驗性動物早期肝癌也具有預(yù)防作用,有望成為肝病治療的理想藥物.我國是肝病大國,肝病患者眾多,目前國內(nèi)銷售的SAM粉針劑(思美泰?)是主要的護肝產(chǎn)品之一,長期依賴進口,價格昂貴,臨床使用受到很大的限制.因此,對SAM 的生產(chǎn)工藝研究是國內(nèi)當(dāng)前急需解決的問題.

SAM可由化學(xué)合成、體外酶促合成或微生物發(fā)酵三種途徑制得.發(fā)酵法是通過在培養(yǎng)基中加入前體L-蛋氨酸來合成,是目前工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)SAM的主要方法[1].釀酒酵母為最常用的發(fā)酵菌種,具有較高的過量積累SAM的能力.劉慧等用啤酒廢酵母聯(lián)產(chǎn)SAM和谷胱甘肽(GSH),含量分別為45 g/g(DCW)和 18 g/g(DCW),生物量為 35 g/L[5].王遠山等從土壤中篩選得到酵母發(fā)酵菌株,通過對培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化,SAM產(chǎn)量從861 mg/L[6]提高到1946 mg/L[7].劉沛溢等采用發(fā)酵過程中流加L-蛋氨酸,SAM積累量最高達4.98 g/L[9].王杰硼等報道了利用釀酒酵母在5 L發(fā)酵罐中加入50 g前體L-蛋氨酸,發(fā)酵65.7 h,SAM 產(chǎn)量達到17.1 g/L[10].在發(fā)酵法生產(chǎn)SAM過程中,通常采用L-蛋氨酸為前體進行發(fā)酵轉(zhuǎn)化,蛋氨酸的轉(zhuǎn)化率僅15%左右.目前市場上L-蛋氨酸價格為168元/kg,L-蛋氨酸的高價格和低轉(zhuǎn)化率,使L-蛋氨酸原料成為發(fā)酵法生產(chǎn)SAM的主要成本,限制了微生物發(fā)酵法規(guī)?；苽銼AM的實際應(yīng)用.為此,筆者在10 L發(fā)酵罐中考察了補加不同類型的蛋氨酸前體對微生物發(fā)酵積累SAM 的影響,發(fā)現(xiàn)以DL-蛋氨酸替代L-蛋氨酸作為前體時,SAM積累量可提高至5.28 g/L,并且可大幅度降低發(fā)酵成本,為工業(yè)化生產(chǎn)SAM提供了新思路.

1 材料與方法

1.1 菌 種

釀酒酵母SAM-J5E-4,由浙江普洛家園藥業(yè)有限公司提供.

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基:麥芽汁 10 g/L,酵母膏 3 g/L,蛋白胨5 g/L,葡萄糖10 g/L,瓊脂20 g/L.

種子培養(yǎng)基:組成同斜面培養(yǎng)基,采用自來水配制.

發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖10 g/L,酵母膏 3 g/L,(NH4)2SO45 g/L,K2HPO410 g/L,硫酸錳 0.1 g/L,硫酸鋅0.1g/L,MgCl20.2 g/L,CaCl20.1 g/L,檸檬酸鈉1 g/L.

流加料液組成:含葡萄糖和酵母抽提物,m(葡萄糖)∶m(酵母提取物)=20∶1,兩者分開滅菌,使用前混合.

1.3 培養(yǎng)條件及轉(zhuǎn)化條件

斜面培養(yǎng):28℃培養(yǎng)2～3 d,4℃冰箱保存.

種子培養(yǎng):從新鮮斜面接種一環(huán)于100 mL種子培養(yǎng)基中,置旋轉(zhuǎn)式搖床,28℃,180 r/min培養(yǎng)24 h.

發(fā)酵罐流加培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化條件:以3%～5%的接種量接種到10 L發(fā)酵罐中,控制溫度為28℃,通氣量為1.0 L/(L·min),攪拌轉(zhuǎn)速開始設(shè)定為300 r/min,待溶氧降低時逐漸增加,轉(zhuǎn)速最高達到700 r/min.發(fā)酵培養(yǎng)約8 h,培養(yǎng)基中葡萄糖消耗完畢時,開始流加葡萄糖和酵母抽提物直至發(fā)酵結(jié)束.當(dāng)發(fā)酵液細胞干重＞80 g/L時,開始流加蛋氨酸前體,進行SAM的合成轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化過程大約持續(xù)21 h.

1.4 分析方法

細胞干重(Dry Cell Weight,DCW)測定:取一定體積的發(fā)酵液,經(jīng)4 000 r/min離心10 min后收集菌體,用去離子水洗滌2次后,105℃烘2 h稱重,計算出細胞的質(zhì)量濃度.

葡萄糖濃度的測定:用酶膜法(生物傳感分析儀SBA-40C,山東省農(nóng)科院).

SAM的定量分析:取5 mL發(fā)酵液于4 000 r/min離心10 min,收集菌體,蒸餾水洗滌后離心,收集的菌體再用1.5 M的高氯酸定容至總體積10 mL,室溫破碎1.5 h,4 000 r/min離心10 min,收集上清液,經(jīng)適當(dāng)稀釋后采用HPLC定量分析.HPLC條件 :Agillent C18柱(250 mm ×4.6 mm,5 μ m);流動相:0.01 mol/L的甲酸銨,用甲酸調(diào)pH值至3.0;流速為1.0 mL/min;檢測波長:256 nm;柱溫:25 ℃;進樣量:10 μL.以標(biāo)準(zhǔn)品(自制的SAM 對甲苯磺酸硫酸雙鹽)峰面積與濃度關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,將256 nm處的樣品峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到SAM含量.

1.5 發(fā)酵罐培養(yǎng)

10 L全自動發(fā)酵罐(鎮(zhèn)江東方)中裝4 L料液,接種量體積分?jǐn)?shù)為10%,前8 h控制攪拌轉(zhuǎn)速為300 r/min,通氣量為6 L/min,如果溶氧＜20%,則調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量,直至攪拌轉(zhuǎn)速為700 r/min,通氣量為15 L/min,溫度控制在28℃,自動補加氨水控制pH值在5左右,外接乙醇在線測定儀(華東理工大學(xué),上海).當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度低于1 g/L時,開始流加葡萄糖和酵母抽提物.當(dāng)發(fā)酵液DCW＞80 g/L時,開始流加蛋氨酸前體,進行SAM的合成轉(zhuǎn)化,蛋氨酸流加時間持續(xù)5 h,轉(zhuǎn)化過程大約持續(xù)21 h,發(fā)酵液降溫至15℃以下,結(jié)束發(fā)酵.實驗過程中定時取樣,所有結(jié)果均為3個樣的平均值.

2 結(jié)果與討論

2.1 不補加前體蛋氨酸的發(fā)酵結(jié)果

圖1,2為不補加前體蛋氨酸時SAM的發(fā)酵過程曲線.由于SAM的合成是一個高能耗的過程,每生成一分子的SAM需要消耗36分子ATP,僅靠葡萄糖消耗產(chǎn)生的ATP能量無法實現(xiàn)高密度積累SAM.結(jié)果表明,在未補加前體蛋氨酸的條件下,SAM的積累量增長很慢,最高為0.38 g/L,生物量最高為128 g/L,在發(fā)酵結(jié)束前,容易積累較高濃度的乙醇.

圖1 未補加前體蛋氨酸的細胞生長和SAM發(fā)酵結(jié)果Fig.1 Cell growth and SAM production without feeding methionine

圖2 未補加前體蛋氨酸的發(fā)酵過程中葡萄糖和乙醇質(zhì)量濃度變化曲線Fig.2 Glucose and ethanol concentration curves without feeding methionine

2.2 補加前體L-蛋氨酸的發(fā)酵結(jié)果

在生物量達到80 g/L時,開始流加L-蛋氨酸前體,流加速率為2 g/(L·h),共流加 5 h,所得發(fā)酵結(jié)果見圖3,4.

由于合成一分子的SAM,需要消耗一分子的蛋氨酸和一分子的AT P,加入前體蛋氨酸,可減少合成蛋氨酸所需的能量,利于SAM 的高密度積累.在補加前體L-蛋氨酸后,SAM快速積累,在開始流加16 h后,SAM 積累量達到最高值,為4.66 g/L,蛋氨酸轉(zhuǎn)化率為17.45%.在生物量達到80 g/L后流加L-蛋氨酸,可使生物量繼續(xù)增加,最高達到147 g/L,說明采用流加方式補加L-蛋氨酸,并沒有對酵母細胞的生長產(chǎn)生明顯的抑制作用.

2.3 補加前體D-蛋氨酸的發(fā)酵結(jié)果

圖5,6為在生物量達到80 g/L時,流加D-蛋氨酸前體的發(fā)酵結(jié)果,流加速率為2 g/(L·h),共流加5 h.釀酒酵母的SAM合成酶不能直接利用D-蛋氨酸.D-蛋氨酸被酵母細胞吸收后,在胞內(nèi)消旋酶的作用下,部分D-蛋氨酸可被轉(zhuǎn)化成L-蛋氨酸,為SAM 合成提供前體.發(fā)酵結(jié)果表明,流加前體D-蛋氨酸,SAM 的積累量最高為1.53 g/L,僅為流加L-蛋氨酸前體時SAM積累量的1/3,蛋氨酸轉(zhuǎn)化率為5.73%.而生物量最高達到124 g/L,表明通過流加方式補加D-蛋氨酸對酵母細胞生長的抑制作用并不明顯.

圖5 補加前體D-蛋氨酸對細胞生長和SAM合成的影響Fig.5 Cell growth and SAM production by feeding D-methionine as precursor

2.4 補加前體DL-蛋氨酸的發(fā)酵結(jié)果

圖7,8為在生物量達到80 g/L時流加DL-蛋氨酸前體的發(fā)酵結(jié)果,補加速率為4 g/(L·h),共流加5 h.在補加2倍量的DL-蛋氨酸前體條件下,釀酒酵母先利用L-蛋氨酸前體合成SAM,同時D-蛋氨酸在酵母細胞內(nèi)消旋酶的作用下轉(zhuǎn)化為L-蛋氨酸,有效補充了合成SAM的前體,從而更利于SAM的積累,SAM的積累量最高為5.28 g/L,蛋氨酸的轉(zhuǎn)化率為9.88%.在該前體流加策略下,生物量最高達131 g/L,表明流加2倍量的DL-蛋氨酸對酵母細胞的生長無影響.

3 結(jié) 論

筆者分別以L-蛋氨酸、D-蛋氨酸和DL-蛋氨酸作為發(fā)酵前體,考察了補加不同類型的蛋氨酸前體對細胞生長和SAM積累的影響.當(dāng)發(fā)酵過程中以2 g/(L·h)的速率流加D-蛋氨酸前體時,SAM 的積累量為1.53 g/L,生物量達124 g/L;以相同速率流加前體L-蛋氨酸時,SAM的積累量達4.68 g/L,生物量為146 g/L.相比較而言,采用4 g/(L·h)的速率流加DL-蛋氨酸前體時,SAM的積累量最高,可達5.28 g/L,生物量為128 g/L,發(fā)酵結(jié)果比較理想.此外,目前市場上DL-蛋氨酸價格約為 L-蛋氨酸價格的1/4左右,因而,以DL-蛋氨酸作為發(fā)酵前體生產(chǎn)SAM,不僅可提高SAM 發(fā)酵水平,同時使發(fā)酵成本大幅度降低,具有很好的實際應(yīng)用前景.

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