趙作濤 孫錚 萬喆 朱平 李若瑜

(1.北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科、北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心,北京 100034;2.北京大學(xué)第一醫(yī)院血液科,北京 100034)

近年來,隨著免疫受損患者不斷增多,侵襲性曲霉病 (Invasive Aspergillosis,IA)的發(fā)病率呈上升趨勢,而且病情十分嚴重。在白血病和骨髓移植受者等重癥免疫受損患者中,IA患者的病死率高達90%,已經(jīng)成為此類患者死亡的主要原因之一,而煙曲霉是 IA最主要的致病真菌[1-5]。

目前臨床主要還是以各種抗真菌藥物作為 IA的主要治療方法,鑒于 IA的患病率上升、病死率極高,而目前臨床正面臨著抗真菌藥物副作用大、治療效果不理想的險峻形勢,進一步尋找更為有效的治療方法成為目前急需解決的重要問題。大量研究表明細胞免疫,特別是 T細胞免疫在宿主清除煙曲霉感染中具有重要作用,T細胞免疫治療 IA具有重要意義和廣闊的應(yīng)用前景[6-14]。免疫治療 IA的最大困難在于煙曲霉的抗原成分十分復(fù)雜,篩選和鑒定合適的煙曲霉抗原表位,通過體外多肽抗原負載樹突狀細胞 (dendritic cells,DC)誘導(dǎo)抗原肽特異性 CTL產(chǎn)生,對于研究 CTL殺傷煙曲霉的機制和多肽疫苗的制備具有重要意義。因此,本文應(yīng)用生物信息學(xué)手段對煙曲霉抗原 Asp f16進行分析,以國人常見的 HLA-A＊0201位點為靶點,對可能的 CTL抗原表位進行預(yù)測,合成多肽并制備多肽特異性 CTL,應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點法 (Enzymelinked immunosorbent assay,ELISPOT)技術(shù)檢測CTL產(chǎn)生的能力,四聚體 (Tetramer)流式細胞儀技術(shù)檢測抗原肽特異性 CTL,從而對生物信息學(xué)預(yù)測的抗原表位進行鑒定,為進一步研發(fā)新型抗煙曲霉T細胞疫苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象

HLA-A＊0201轉(zhuǎn)基因小鼠 (C57BL/6背景)購自于美國 Jackson Laboratory,于 SPF環(huán)境養(yǎng)殖,轉(zhuǎn)基因小鼠表達人類 MHC-I類分子 HLA-A＊0201[15]。

1.2 生物信息學(xué)預(yù)測煙曲霉抗原 Asp f16的 HLAA＊0201限制性 CTL抗原表位

利用文獻報道及生物信息學(xué)資源,我們從 NCBI數(shù)據(jù)庫 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得煙曲霉抗原Asp f16(編碼基因 crf1,GenBank entry AJ223327,Genomic locus Afu 1g16190)的全部 427個氨基酸序列,使用由美國國家生物技術(shù)中心 (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla bind/)和德國Tubingen大學(xué)免疫系 (http://www.syfpeithi.de/Scripts/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)提供的生物信息學(xué)軟件掃描了煙曲霉抗原Asp f16的全部 427個氨基酸序列[16]。鑒于國人常見的 HLA位點是 HLA-A＊0201,我們選擇了該位點作為靶點,根據(jù)與 HLA分子穩(wěn)定性半衰期評分篩選出預(yù)測分數(shù)較高的 3條 9肽 (見表 1)。

表 1 抗原表位生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果Tab.1 Prediction of HLA peptides motif

1.3 多肽合成

根據(jù)生物信息學(xué)軟件篩選結(jié)果,合成 3條HLA-A＊0201限制性 9肽 (P1,P2,P3)以及與煙曲霉無關(guān)的對照肽 (來源于血液腫瘤抗原核仁磷蛋白 NPM1,CLAVEEVSL)。4條多肽交予上海強耀生物科技有限公司 (ChinaPeptides Co.,Ltd.)合成,高效液相色譜儀 (HPLC)測定其純度 >95%。1 mg多肽溶解在 20μL的 DMSO(sigma)中,每支EP管 5μL分裝,-30℃冷凍保存。

1.4 HLA-A＊0201轉(zhuǎn)基因小鼠 DC的制備

HLA-A＊0201轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)脫頸椎處死,浸入75%酒精中。5 min后,在生物安全柜內(nèi)無菌操作游離脛骨,置于無菌 PBS中。剪掉骨兩端,使用RPMI 1640完全培養(yǎng)液 (Hyclone,含 10%胎牛血清,青霉素 100 U/mL,鏈霉素 100μg/mL,Gibco)反復(fù)沖洗骨髓腔,將獲得的細胞懸液置于 RPMI 1640完全培養(yǎng)液中,37℃,5%CO2培養(yǎng)箱 (Thermo)孵育。4 h后輕柔吸去懸浮未貼壁的細胞,以RPMI 1640完全培養(yǎng)液輕柔沖洗 3遍,以除去未貼壁細胞。更換新的 RPMI 1640完全培養(yǎng)液,同時加入細胞因子 GM-CSF(R＆D,終濃度 20 ng/mL)和IL-4(R＆D,終濃度 10 ng/mL)。第 4天,全量更換1次 RPMI 1640完全培養(yǎng)液。第 5天,向培養(yǎng)體系加入 TNF-α(R＆D,終濃度 10 ng/mL)。第 7天 ,收獲培養(yǎng)體系內(nèi)的細胞。

1.5 成熟 DC的表型鑒定

收集培養(yǎng)第 7天的 DC,調(diào)整細胞濃度至 1×107/mL,與以下抗體孵育:FITC-Anti Mouse I-Ab(AF6-120.1),PE-Anti Mouse CD80(16-10A1);FITC-Anti Mouse CD11c(N418),PE-Anti Mouse CD86(GL-1)。對照抗體分別為:FITC-Mouse Ig2a κIsotype Ctrl(MOPC-173),PE-Armenian Hamster IgG Isotype Ctrl(HTK-888),FITC-Armenian Hamster IgGIsotype Ctrl(HTK-888),PE-Rat IgG2aκI-sotype Ctrl(RTK2758),全部抗體均購置美國 Biolegend公司。將 100μL細胞 (106)與熒光單抗于4℃反應(yīng) 30 min,PBS洗 3次后流式細胞儀 (BD,LSR)檢測表型。

1.6 成熟 DC的抗原肽負載

成熟 DC分為兩組,分別加入 DMSO溶解的實驗組多肽和對照肽組多肽,使其濃度皆為 50μg/mL,37℃,5%CO2條件培養(yǎng) 2 h,用無血清的 RMPI 1640培基洗滌 3次后,顯微鏡下計數(shù),以 25 Gy放射當量輻照細胞,作為體外刺激 T細胞的抗原提呈細胞 (Antigen Presenting Cell,APC)備用。

1.7 抗原肽預(yù)先免疫的小鼠淋巴結(jié)細胞懸液的制備

初次免疫,無菌條件下將 1 mg實驗組多肽抗原 (P1、P2、P3以 1∶1∶1的比例混合)以及對照肽分別溶于 10μL DMSO中,再溶于 0.5 mL PBS中,與 0.5 mL弗氏完全佐劑 (CFA;Sigma,St.Louis,MO)完全混勻。75%酒精棉球消毒 HLA-A＊0201轉(zhuǎn)基因小鼠尾根部,尾根部左右兩側(cè)皮下分別注入抗原肽與弗氏佐劑混勻物約 50μL。

加強免疫,無菌條件下將 1 mg實驗組多肽抗原以及對照肽分別溶于 10μL DMSO中,再溶于 0.5 mL PBS中,與 0.5 mL弗氏不完全佐劑 (IFA;Sigma,St.Louis,MO)完全混勻。初次免疫后 10～14 d,實施再次免疫。用 75%酒精棉球消毒其尾根部,在其尾根部左右兩側(cè)皮下分別注入抗原肽與弗氏佐劑混勻物約 50μL。

再次免疫后 7～10 d后,將小鼠經(jīng)脫頸椎處死,浸入 75%酒精中。10 min后,在超凈臺內(nèi)小心取出已經(jīng)腫大的腹股溝淋巴結(jié) (左右各 1個),置于 RPMI 1640培養(yǎng)液中備用。收集齊所有小鼠腹股溝淋巴結(jié)后,每組分別置于 150目篩網(wǎng)上,以 5 mL注射器活塞研磨,研磨過程中不時用培養(yǎng)液沖洗篩網(wǎng),獲得單細胞懸液。以 1640培養(yǎng)液,400 g,離心 10 min,調(diào)細胞濃度為 1×106/mL備用。

1.8 抗原肽特異性 CD8+CTL的制備

將輻照后的 DC與貼壁 4 h后的淋巴結(jié)細胞懸液中未貼壁細胞以 1∶10的比例混合均勻,RPMI 1640完全培養(yǎng)液,開始第一輪體外活化。5 d后換液,另外添加 IL-2(R＆D,終濃度 10 ng/mL),5 d后再次加入新制備的輻照后的 DC,開始第二輪的刺激。經(jīng)過 3～4輪的體外刺激,并進一步使用紅細胞裂解,死細胞去除試劑盒 (Dead Cell Removal Kit,Miltenyi Biotec,Germany),免疫磁珠負性分選CD8+T淋巴細胞 (CD8+TCell Isolation Kit,Miltenyi Biotec,Germany)得到純度較高的抗原肽特異性T淋巴細胞群 (另文發(fā)表)。

1.9 抗原肽特異性 CD8+CTL的 Tetramer流式細胞儀檢測

由荷蘭 Sanquin公司設(shè)計并合成 P1,P2,P3表位特異性 PE-Tetramer。取 6組分選后的 CD8+CTL,每組 2 mL,細胞濃度為 1×106/mL。取其中3組作為實驗組,300 g,10 min離心后,吸棄上清,加入 40μL含 0.5%胎牛血清的 PBS,分別與10 μL的 P1-PE-Tetramer、P2-PE-Tetramer、P3-PETetramer混合,在 18～25℃條件下孵育 20 min;再分別與 APC anti-mouse CD8a(clone 53-6.7,Biolegend)2μL混合,4℃條件下孵育 30 min。3個對照組的染色抗體為 APC-Rat IgG2a,κIsotype Ctrl(clone RTK2758,Biolegend)2μL混合,4℃條件下孵育 30 min。PBS洗滌 3遍后,300 g,10 min離心,各組皆調(diào)濃度 1×106/mL,4℃保存,流式細胞儀檢測表型。

1.1 0 ELISPOT技術(shù)檢測 CD8+CTL對特異性抗原刺激的反應(yīng)

所用試劑盒為Mouse IFN-γPrecoated ELISPOT kit(達科為生物技術(shù)有限公司)。實驗分組:APHA(sigma)陽性對照組 +抗原肽特異性 CD8+CTL;B-抗原肽特異性 CD8+CTL;C-抗原肽負載的樹突狀細胞 +抗原肽特異性 CD8+CTL;D-對照肽負載的樹突狀細胞 +對照肽特異性 CD8+CTL;E-空白樹突狀細胞 +抗原肽特異性 CD8+CTL;F-空白樹突狀細胞 +對照肽特異性 CD8+CTL。具體操作見參考文獻[9]。

2 結(jié) 果

2.1 煙曲霉特異性抗原肽的生物信息學(xué)預(yù)測

在前期工作基礎(chǔ)上,我們使用由美國國家生物技術(shù)中心和德國 Tubingen大學(xué)免疫系提供的生物信息學(xué)軟件掃描了位于煙曲霉細胞壁的抗原 Asp f16的全部 427個氨基酸序列[16]。鑒于國人最常見的 HLA位點是 HLA-A＊0201,我們選擇了該位點作為靶點,并根據(jù)與 HLA分子穩(wěn)定性半衰期評分篩選并合成了 3條 9肽 (見表 1)。

2.2 體外培養(yǎng)小鼠骨髓造血干細胞來源的 DC及成熟 DC的表型鑒定

貼壁細胞在 mGM-CSF和 mIL-4培養(yǎng) 3 d時,DC數(shù)量明顯增多,并有部分細胞懸浮,懸浮細胞有小的突起,出現(xiàn)大量半貼壁半懸浮的集落,集落表面的細胞有小的突起。第 4天,細胞增加更多,表面出現(xiàn)長長的樹枝狀突起。第 5天加入 TNF-α促使其成熟,至第 7天培養(yǎng)液中的大部分細胞已經(jīng)基本成熟,成較大的圓球形,表面有刺狀突起。培養(yǎng) 7 d的 DC,經(jīng)過 4種熒光抗體的標記之后,顯示表達各種標記抗體對應(yīng)的表面分子細胞數(shù)量百分比為:MHCⅡ-32.80%,CD80-52.39%,CD11c-55.38%,CD86-43.15%,表明所培養(yǎng)的樹突細胞已經(jīng)達到相當程度的表型成熟。證實我們建立了穩(wěn)定的樹突狀細胞的體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)成熟體系 (見圖 1)。

2.3 體外檢測抗原肽特異性 CTL的研究

預(yù)先皮下免疫獲得的引流淋巴結(jié)來源的 T細胞,經(jīng)過 APC(負載抗原肽的樹突狀細胞)體外 2～4輪的刺激:第一輪前 5 d不加細胞因子 IL-2,目的是確保非特異性 T細胞死亡,以提高抗原特異性T細胞的純度;從第二輪開始,細胞快速增殖,每隔1 d就要傳代;至第 3～4周特異性 CTL達到一定純度,經(jīng)過溶紅、去死、CD8陰選一系列處理之后,以 PE標記的 P1、P2、P3特異性四聚體和 APC標記的 CD8a熒光抗體共同染色。結(jié)果表明,CD8分子陽性率為 90%以上。Tetramer實驗顯示 P1、P2、P3的陽性表達率即 3種 9肽特異性 CTL所占的比率分別為 10.66%,7.29%,5.03%(見圖 4)。因此,我們應(yīng)用 Tetramer實驗證實了煙曲霉 3種抗原肽與 HLA-A＊0201分子的親和力 (見圖 2)。

2.4 ELISPOT煙曲霉特異性抗原肽體外活化 T細胞的研究

我們應(yīng)用 ELISPOT實驗驗證生物信息學(xué)預(yù)測的煙曲霉抗原多肽體外可以活化 CTL并產(chǎn)生細胞因子 IFN-γ?？乖岢始毎c CD8+CTL經(jīng)過 20 h的作用,不同分組孔內(nèi)產(chǎn)生細胞因子 IFN-γ的 T細胞的數(shù)量不同:①陽性對照組在低濃度絲裂原PHA的刺激下,一部分煙曲霉肽特異性 CTL分泌IFN-γ。②無 APC的刺激時,煙曲霉肽特異性 CTL幾乎不分泌 IFN-γ,細胞數(shù)僅為 (4.0±3.6)spots/well。③在特異性 APC的刺激下,數(shù)量很多的煙曲霉肽特異性 CTL分泌 IFN-γ,高達 (266.0±39.2)spots/well。④在對照肽負載 DC刺激下,數(shù)量很多的對照肽特異性 CTL分泌 IFN-γ。⑤非抗原負載DC刺激下,很少數(shù)目的煙曲霉肽特異性 CTL分泌IFN-γ。⑥非抗原負載 DC刺激下,很少數(shù)目的對照肽特異性 CTL分泌 IFN-γ。具體數(shù)值見圖 2。這些結(jié)果表明煙曲霉抗原肽和對照肽體外可以活化相應(yīng)的 CD8+CTL并產(chǎn)生 IFN-γ(見圖 3)。

3 討 論

IA是一種主要由煙曲霉引起,通常侵犯免疫力受損人群的破壞性和致死率極高的惡性感染,病情的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸取決于煙曲霉的侵襲力和宿主的抗真菌免疫能力之間的平衡[7,8]。通常情況下,人們每天都會吸入大量煙曲霉孢子,對于免疫力正常的宿主,以中性粒細胞和巨噬細胞為代表的固有性免疫與以 T淋巴細胞為主導(dǎo)的特異性免疫可以迅速將侵入體內(nèi)的煙曲霉完全清除,而不發(fā)病[8]。然而對于免疫受損患者,不能及時徹底清除煙曲霉這種生長繁殖非常迅速的病原真菌,一旦感染,后果十分嚴重。

圖 1 小鼠骨髓來源的樹突狀細胞體外表型。小鼠骨髓來源的樹突狀細胞在添加了細胞因子 rmGM-CSF(20 ng/mL)和 rmIL-4(10 ng/mL)的R10培養(yǎng)基中孵育。第 5天,加入 rmTNF-alpha(10 ng/mL),第 7天,收獲樹突狀細胞,染色,流式細胞儀分析 圖 2 Tetramer實驗檢測Asp f16多肽特異性 T細胞。Asp f16多肽特異性CD8+T細胞 (1×106/mL)與 Asp f16特異性 tetramer,APC熒光標記的抗鼠 CD8a單克隆抗體 4℃染色 30 min,然后進行流式細胞儀分析 圖 3 ELISPOT實驗檢測 CD8+CTL特異性 IFN-γ的釋放。5×103樹突狀細胞與 25μg/mL Asp f16多肽混合物或者對照肽37℃孵育 2 h,然后與 5×104同源的CTL共孵育 20 h。使用PHA作為陽性對照,每一個柱狀圖代表 3次實驗的標準值 ±SD。A-PHA刺激 Asp f16多肽特異性 CTL;B-Asp f16多肽特異性 CTL;C-Asp f16多肽負載的樹突狀細胞活化Asp f16多肽特異性CTL;D-對照肽負載的樹突狀細胞活化對照肽特異性CTL;E-無多肽負載的樹突狀細胞活化 Asp f16多肽特異性 CTL;F-無多肽負載的樹突狀細胞活化對照肽特異性CTLFig.1 Phenotypes of the in vitro generated murine dendritic cells derived from bone marrow.The DCswerecultured in the R10medium supplemented with rmGM-CSF(20 ng/mL)and rmIL-4(10 ng/mL).On day 5,rmTNF-alpha(10 ng/mL)was added in and the DCs were harvested and analyzed by flow cytometry on day 7 Fig.2 Tetramerbased detection of Asp f16 peptides-specific T cells.Asp f16 peptidespecific CD8+Tcells(1×106/mL)were stained with Asp f16-specific tetramers and APC-labeled anti-mouse CD8amonoclonal antibody at 4℃for 30 minites.The cells were then analyzed by flow cytometry Fig.3 Specific IFN-γrelease by in vitro-stimulated CD8+CTL measured by ELISPOT.Dendritic cells(5×103)were incubated with 25μg/mL of Asp f16 peptides mixtures or control peptide at 37℃for 2 hours and then co-cultured with 5×104 autologous CTLs in each well for 20 hours.PHA was used as positive control in all assays.Each value was represented as the mean±SD.A-PHA stimulated Asp f16 peptides specific CTLs;B-Asp f16 peptides specific CTLs alone;C-Asp f16 peptides loaded DCs plus Asp f16 peptides specific CTLs;D-Control peptide loaded DCs plus control peptide specific CTLs;E-Peptide unloaded DCs plus Asp f16 peptides specific CTLs;F-Peptide unloaded DCs plus control peptide specific T cells

流行病學(xué)研究表明 IA的發(fā)病人群構(gòu)成主要是造血干細胞移植患者、移植物抗宿主病患者、實體器官移植患者、腫瘤化療患者、HIV感染者等,這類患者常常伴有嚴重的 T細胞免疫功能缺陷[1-5]。國內(nèi)外大量研究也表明 T細胞免疫在宿主清除煙曲霉感染中具有重要作用,研究者發(fā)現(xiàn)通過過繼轉(zhuǎn)移煙曲霉培養(yǎng)粗提物抗原活化的小鼠 T細胞,能顯著增加后繼靜脈內(nèi)給予煙曲霉孢子的小鼠的存活率,從而證實了煙曲霉特異性 T細胞具有免疫治療作用[7,9-11]。因此,體外建立供體來源的煙曲霉特異性 T細胞克隆,在受體對 IA易感時期 (例如:HSCT后早期,預(yù)防及治療 GVHD時),過繼轉(zhuǎn)移給受體,可以建立受體針對煙曲霉的特異性免疫反應(yīng)能力,從而保護受體免于發(fā)病或者增強其對治療的反應(yīng)性,免疫治療 IA具有重要意義和廣闊的應(yīng)用前景[12-14]。

但是,我們的前期工作結(jié)果顯示煙曲霉孢子的免疫原性較差,獲得的煙曲霉特異性分泌 IFN-γ的Th1細胞絕對值較低,與國內(nèi)外的研究結(jié)果較一致[7,17]。目前的多數(shù)研究使用煙曲霉孢子、菌絲或者煙曲霉胞壁蛋白粗提物作為抗原,除了含有相關(guān)的特異性抗原外,還包括大量的非相關(guān)抗原成分,包括糖類、蛋白質(zhì)、核酸甚至毒素[6,10-14,17]。它的主要缺點是抗原為混合物,純度低,且免疫原性不強,不適合臨床應(yīng)用,甚至危及患者生命。因此,篩選和鑒定合適的煙曲霉抗原表位,成為提高過繼免疫治療 IA療效的關(guān)鍵問題。

研究發(fā)現(xiàn)煙曲霉重組過敏原 Asp f16(編碼基因crf1,GenBank entry AJ223327,Genomic locus Afu1g16190)可以引起顯著的 T細胞免疫應(yīng)答[18,19]。研究者使用 Asp f16抗原作為疫苗免疫小鼠,誘導(dǎo)保護性 T細胞應(yīng)答,增加了小鼠對抗肺煙曲霉感染的能力和存活時間[20]。據(jù)此,本研究根據(jù)煙曲霉抗原 Asp f16的氨基酸全序列信息,利用生物信息學(xué)軟件,以我國漢族人群常見的限制性位點 HLA-A＊0201為靶點篩選合成 3條 HLA-I限制的 9肽,誘導(dǎo)產(chǎn)生煙曲霉特異性的 CTL,并進行實驗室鑒定[16]。篩選和鑒定已知氨基酸序列抗原的 T細胞表位通常采用全長序列范圍內(nèi)的基序預(yù)測法和肽段重疊法,本研究采用基序預(yù)測法通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測煙曲霉抗原表位,與肽段重疊法相比較,可節(jié)省大量人力物力,可以作為一個快速高效篩選合適抗原肽的工作平臺。

本研究建立了轉(zhuǎn)人基因 HLA-A＊0201小鼠 DC培養(yǎng),誘導(dǎo)成熟,抗原遞呈,以及 CTL體外擴增體系,為進一步在實驗動物體內(nèi)模擬了人體發(fā)病和免疫應(yīng)答反應(yīng)的過程,評估多肽特異性 CTL在免疫治療 IA的作用和 CTL殺傷煙曲霉的機制研究奠定基礎(chǔ)。選擇轉(zhuǎn)人基因 HLA-A＊0201小鼠作為研究對象,將合成的生物信息學(xué)預(yù)測得到的煙曲霉Asp f16抗原肽預(yù)先皮下免疫 HLA-A＊0201轉(zhuǎn)基因小鼠,可以模擬體內(nèi)免疫環(huán)境,獲得的引流淋巴結(jié)來源的 T細胞,使免疫反應(yīng)最大化和最優(yōu)化[15]。通過已有的技術(shù)平臺,體外負載成熟的樹突狀細胞,由其加工、遞呈給 T細胞,在體外制備煙曲霉多肽特異性 CTL[7]。MHC-四聚體試驗證實了生物信息學(xué)預(yù)測的抗原表位與 HLA-A＊0201分子具有很強的的結(jié)合能力。ELISPOT試驗證實生物信息學(xué)預(yù)測的煙曲霉 Asp f16的抗原肽可以活化 T細胞,并釋放大量 IFN-γ。因此,本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測的 3個抗原肽,經(jīng)實驗室鑒定為煙曲霉抗原Asp f16的 HLA-A＊0201限制性 CD8+CTL的抗原表位,可作為今后設(shè)計抗煙曲霉多表位肽疫苗的備選肽,并為進一步研究 CTL殺傷煙曲霉機制和免疫治療 IA提供參考。

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