鐘狂飆，桂明，朱立勇 , 李維，管茶香，郭方遒

(1. 中南大學 湘雅三醫(yī)院泌尿外科，湖南 長沙，410083；2. 中南大學 化學化工學院，湖南 長沙，410083)

全世界每年有300萬人死于與吸煙有關的疾病，煙草給人類健康帶來嚴重威脅。俄羅斯科學院X線放射學與毒理學科研所研究人員用原子吸附分析法對志愿者血液中的重金屬Pb，Cd和Mn的含量進行了測定，發(fā)現(xiàn)吸煙加劇了體內(nèi) Cd等重金屬的積累，這些重金屬會破壞和影響細胞內(nèi)受損 DNA的修正與恢復[1]。香煙煙葉由于受其生長環(huán)境的污染以及煙葉自身種類特點的影響，都會含有一定量的重金屬等有害元素，如Pb，Cr，Cd和Hg等[2]。煙絲比其他植物更能從土壤中聚積Cd，煙葉中Cd的含量要比允許的含量高許多倍[3-4]。吸煙對血清中 Cu，Zn，F(xiàn)e，Pb和Cd等金屬元素有明顯的影響。據(jù)報道，吸煙者Pb和Cd含量比不吸煙者含量明顯增高，且與吸煙量呈正相關[5]，金屬離子尤其是Ni和Cd在腎臟組織中具有蓄積特點[6-9]。目前，人們對吸煙對動物體內(nèi)組織和血液中金屬元素的蓄積效應研究較少。在此，本文作者以大白兔為研究對象，測定其腎臟組織在吸煙前后多種有害金屬元素的蓄積作用。電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)與經(jīng)典的火焰法、電弧法、火花光譜分析法及原子吸收法相比，其線性動態(tài)范圍寬 4～5個數(shù)量級，且具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、基體效應小、分析速度快、可同時分析多元素等優(yōu)點，已廣泛應用于生物樣中微量元素的測定[10-13]，為此，采用ICP-AES法測定了大白兔在吸煙前后血液和組織中多種金屬元素的含量，以便為進一步研究吸煙對動物腎臟損傷的生物學研究作好前期工作。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器為iCAP 6500型電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(美國熱電公司)。

試劑為乙醇、硝酸、高氯酸、氫氟酸和鹽酸，均為優(yōu)級純。實驗用水為二次去離子水。

1.2 儀器工作條件

高頻頻率為27.68 MHz，發(fā)射功率為1 150 W，冷卻氣流量為1.5 L/min，輔助氣流量為0.5 L/min，霧化室壓力為179 kPa，溶液提升量為1.85 mL/min。觀測高度為 15 mm，積分時間為 15 s，氬氣純度大于99.99%。對于分析線(波長)：Hg為194.20 nm，Se為361.38 nm，Sn為189.90 nm，Pb為220.35 nm，Cd為228.80 nm，Ni為231.60 nm，Cr為205.55 nm。

1.3 工作曲線及檢出限

Hg，Cr，Ni，As，Se，Cd和Pb的標準溶液均購自國家標準物質(zhì)中心，標準系列工作溶液按需要由體積分數(shù) 5%的 HNO3介質(zhì)逐級稀釋而成，分別配制成0，0.01. 0.05，0.10，0.20，0.50，1.00，1.50，2.00 和10.00 mg/L標準質(zhì)量濃度，以凈光強為縱坐標，以元素的質(zhì)量濃度為橫坐標繪制校準曲線。對試劑空白進行 10次測定，儀器自動計算檢出限。

1.4 動物吸煙模型

采用實驗動物被動吸煙方式(圖1)，最大限度地模擬人類吸煙。由于煙氣中含有的多種有害物質(zhì)在側(cè)流煙霧中的含量還要高于主流煙霧含量[14]，故被動吸煙者完全可能造成與主動吸煙者同樣的危害。采用真空泵抽吸裝置模擬人類吸煙時肺內(nèi)負壓狀態(tài)，將香煙煙氣通過真空泵向動物吸煙箱內(nèi)脈沖泵入；同時，氧氣經(jīng)流量計，與煙氣融合進入動物吸煙間。吸煙間內(nèi)置氧氣濃度檢測儀，通過檢測吸煙間內(nèi)氧氣體積分數(shù)，控制其為20%～21%，間接估計其中煙氣質(zhì)量濃度。香煙煙氣經(jīng)過管道長度盡量縮短，以減少煙氣中各成分貼壁黏附損耗。并定時(1周/次)清洗煙氣管道及動物吸煙間，減少管道、室壁煙氣尤其焦油殘余量存留。

圖1 模擬動物吸煙裝置圖Fig.1 Simulated animal smoking equipment

1.5 樣品制備

采用普通級實驗用大白兔(購自湖南寧鄉(xiāng)實驗動物飼養(yǎng)廠)。實驗前，均在實驗室圈養(yǎng)20 d，再開始動物實驗。兔子均為成年大白兔，體質(zhì)量達1.75 kg以上。

實驗動物分為4組：空白對照組(E組)、蓋白沙煙組(H組)、白沙精品二代煙(J組)和NISE煙組(N組)。每組動物又分吸煙2周組、4周組、8周組、12周組和16周組，每組6只，每組給予相同的基礎飼料自由采食，吸煙組按給定時間采用實驗動物被動吸煙方式吸煙，到給定吸煙時間后通過斷頸椎處死取腎臟樣品。

腎臟組織置于經(jīng)鹽酸處理的潔凈稱量瓶內(nèi)，于80 ℃烘干至恒質(zhì)量，烘干組織后將其粉碎。采用微波加熱高壓聚四氟乙烯罐酸濕消化法消化組織樣品，稱取20.0 mg恒質(zhì)量后樣品，置于容樣杯中，然后加入5 mL 70% HNO3和1 mL 30% H2O2，采用2檔消化7 min，消化完全后定容至10 mL。

2 結果與討論

2.1 分析譜線的選擇

由于電感耦合等離子體光源激發(fā)能量很高，有大量發(fā)射譜線，幾乎每種元素的分析線都受到不同程度的干擾。選擇分析線一方面要保證其有足夠的靈敏度，另一方面要盡量避免其他譜線重疊干擾。本試驗中對每個元素選取2～3條譜線測定，綜合元素的檢出限、共存元素干擾、背景干擾和該元素的線性范圍，經(jīng)實驗確定的各元素分析波長分別為：Hg 194.20 nm，Se 361.38 nm，Sn 189.9 nm，Pb 220.35 nm，Cd 228.80 nm，Ni 231.60 nm，Cr 205.55 nm。

2.2 方法的檢出限、回收率和精密度

根據(jù)標準曲線繪制，經(jīng)試驗測得各元素標準曲線在 0～2.0 mg/L之間呈線性良好，相關系數(shù)(r)均大于0.999。按樣品處理方法對10份空白溶液進行測定，取標準偏差的3倍為各元素的檢出限，Hg，Se，Sn，Pb，Cd，Ni和Cr 的檢出限分別為：Hg 5.9 μg/L，Se 22 μg/L，Sn 22 μg/L，Pb 22 μg/L，Cd 2.7 μg/L，Ni 3.7 μg/L，Cr 6.1 μg/L。按實驗方法從組織樣品溶液中選取第12周樣品7份進行加標回收率測定，用ICP-A ES同時測定以上7種元素的含量，計算加標回收率見表1。各元素回收率為95.0%～ 104.2%，準確度較好，表明方法可用于實際樣品分析。

2.3 金屬元素在腎臟中的蓄積效應

金屬離子尤其是Ni和Cd在動物體內(nèi)具有蓄積特點[15]。已有研究表明，重金屬離子對腎臟有損傷作用。本文中對大白兔經(jīng)被動吸煙后2周、4周、8周、12周和16周后采用斷頸法處死，收集腎臟標本，取得其腎臟組織，測得各金屬離子在其中的質(zhì)量濃度，結果如表2所示。

從表2可以看出：大白兔在被動吸食3種不同香煙后，腎臟中Hg，Se，Sn，Pb，Cd，Ni和Cr的質(zhì)量濃度隨吸食時間的增加而增加；吸食到12周以后金屬離子質(zhì)量濃度變化趨于穩(wěn)定，其中以Hg，Se和Pb的質(zhì)量濃度變化更為明顯，Sn和Ni的質(zhì)量濃度變化很小，幾乎沒有蓄積效應。如圖2所示為吸食3種不同香煙NISE、精白沙、盒白沙12周后，Hg，Se，Pb，Cd和Cr這5種金屬離子在大白兔腎臟中的質(zhì)量濃度分布。結果表明：吸食此3種香煙后，金屬離子質(zhì)量濃度都有明顯增加，NISE煙組的質(zhì)量濃度表現(xiàn)最顯著，NISE煙組中Hg，Se，Pb，Cd和Cr的質(zhì)量濃度分別達到1.022，1.822，0.750，0.124和0.152 mg/L，為正常組的 6.6，9.1，13.9，5.7和 4.8倍；Ni和 Sn的質(zhì)量濃度變化較小，可能和煙葉中該2種組分質(zhì)量濃度較小有關。金屬離子在腎臟組織中具有蓄積作用，Hg，Se，Pb，Cd和Cr這5種金屬離子在香煙組與對照組相比明顯提高，表明其在腎臟中蓄積，可能導致腎臟炎癥，纖維組織增生的原因有待進一步研究。

表1 腎臟樣品中金屬離子的回收率(n=7)Table 1 Recoveries of metal ion in kidney

表2 腎組織中金屬質(zhì)量濃度Table 2 Contents of metal ions in kidney of rabbit mg/L

圖2 吸食不同香煙后金屬離子在大白兔腎臟中的蓄積作用Fig.2 Accumulation effect of metal ions in kidney of rabbit after smoking different kinds of cigarettes

3 結論

(1) 建立了電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法測定動物組織中痕量和微量重金屬離子含量的方法。本方法準確度高，精密度好，適合于動物腎臟樣品中微量重金屬離子質(zhì)量濃度的同時測定。

(2) 利用動物被動吸煙模型，考察大白兔在吸食3種不同香煙后不同時期后腎臟中7種重金屬離子的質(zhì)量濃度變化，發(fā)現(xiàn)Hg，Se，Pb，Cd和Cr離子在其腎臟中具有明顯的蓄積作用，經(jīng)12周后，以上幾種元素在體內(nèi)質(zhì)量濃度較正常組分別高 5.6，8.1，12.9，4.7和3.8倍。

[1] 襲著革, 晁福寰, 孫詠梅, 等. 金屬離子介導活性氧引起DNA氧化損傷及機制研究[J]. 環(huán)境科學學報, 2003, 23(5):662-667.XI Zhu-ge, CHAO Fu-huan, SUN Yong-mei, et al. Study on the mechanism of oxidative damage of DNA induced by reactive oxygen species due to metal ions[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2003, 23(5): 662-667.

[2] 王瑞, 祁爭健, 王宏義. 香煙煙氣中水溶性重金屬含量的測定[J]. 光譜實驗室, 2004, 21(2): 321-323.WANG Rui, QI Zeng-jian, WANG Hong-yi. Determination of water-soluble heavy metal elements in gas of cigarette[J].Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory, 2004, 21(2):321-323.

[3] 朱志國, 王桂賢, 程靜華. 用火焰原子吸收法測定十種香煙中鉀、鈣、錳、鉻和鎘[J]. 光譜學與光譜分析, 1999, 19(2):210-211.ZHU Zhi-guo, WANG Gui-xian, CHENG Jing-hua.Determination of potassium, calcium, manganese, chromium and cadmium in 10 kinds of cigarettes by flame atom’s absorption spectrophotometer[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 1999,19(2): 210-211.

[4] Verma S, Yadav S, Singh I. Trace metal concentration in different Indian tobacco products and related health implications[J]. Food and Chemical Toxicology, 2010, 48:2291-2297.

[5] 邱曉輝, 魏德仁. 吸煙對血清中金屬元素的影響[J]. 中國公共衛(wèi)生, 1994, 10(1): 20-21.QIU Xiao-hui, WEI De-ren. Effect of content of metal elements in blood serum[J]. Journal of Public Health, 1994, 10(1): 20-21.

[6] 李天才, 索有瑞. 藏成藥七十味珍珠丸中礦物質(zhì)元素在體內(nèi)蓄積性水平研究[J]. 中國科學院研究生院學報, 2003, 20(3):348-352.LI Tian-cai, SUO You-rui. Study on body storage level of mineral elements from tibetan medicine seventy flavors pearl pill[J]. Journal of the Graduate School of the Chinese Academy of Sciences, 2003, 20(3): 348-352.

[7] 余毅, 謝福安. 藥物與重金屬所致的中毒性腎病[J]. 新醫(yī)學,2005, 36(9): 545-546.YU Yi, XIE Fu-an. Toxic nephropathy due to heavy metals and medicine[J]. New Medicine, 2005, 36(9): 545-546.

[8] Playle R C, Dixon D G, Burnison K. Copper and cadmium binding to fish gills: Estimates of metal-gill stability contents and modeling of metal accumulation[J] . Can J Fish A quat Sci,1993, 50: 2678-2687.

[9] Clark S, Grote J, Wilson J, et al. Occurrence and determinants of increase in blood lead levels in children shortly after lead hardard control activities[J]. Environmental Research, 2004,96(2): 196-205.

[10] 胡蘭基, 馬文, 馬龍, 等. 電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜法測定紅景天中鋅、鐵、錳和鈦[J]. 光譜實驗室, 2010, 27(3):1156-1159.HU Lan-ji, MA Wen, MA Long, et al. Determination of Zn, Fe,Mn and Ti in Rhodiola by ICP-AES[J]. Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory, 2010, 27(3): 1156-1159.

[11] 王小燕, 李玉鋒, 李柏, 等. 稀釋法快速測定人體血液和尿液中多種重金屬元素分析試驗室, 2010, 29(6): 41-45.WANG Xiao-yan, LI Yu-feng, LI Bai, et al. Fast determination of heavy metals in human blood and urine samples by ICP-MS after simple dilution[J]. Chinese Journal of Analysis Laboratory,2010, 29(6): 41-45.

[12] Leonardo S G, Teixeira, Jose′ Oscar N. Reis, Anto?nio C.S.Costa, et al. ICP–AES determination of small amounts of zinc in copper-base alloys after separation by adsorption of the zinc–TAN complex on Sep Pak C18 cartridges[J]. Talanta, 1998,46(5): 1279-1283.

[13] Chew L T, Bradley DA, Amin Yuso Mohd, et al. Zinc, lead and copper in human teeth measured by induced coupled argon plasma atomic emission spectroscopy (ICP-AES)[J]. Applied Radiation and Isotopes 2000, 53(4/5): 633-638.

[14] Ricket W S. Nicotine and carbon monoxide in the sidestream smoke from 15 brands of Canadian cigarettes[J]. Am J of Public health, 1984, 73(3): 228-232.

[15] 方展強, 楊麗華. 重金屬在鯽幼魚中積累與分布[J]. 水利漁業(yè), 2004, 24(6): 23-26.FANG Zhan-qiang, YANG Li-hua. Accumulation and distribution of heavy metal in baby carp[J]. Reservoir Fisheries,2004, 24(6): 23-26.