劉燕妮，索占偉，楊 嫻，時(shí) 蕾，曹 靜，李 帥，許英明，楊鴻斌，胡曉東

(蘭州大學(xué)藥學(xué)院分子藥理研究所，甘肅蘭州 730000)

AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid)型谷氨酸受體介導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)中絕大部分的快反應(yīng)興奮性突觸傳遞。在脊髓背角，生理性痛刺激通過初級傳入纖維，向脊髓釋放谷氨酸，激活突觸后AMPA受體，促進(jìn)痛覺信息向更高級的中樞傳遞。而當(dāng)外周組織或神經(jīng)損傷之后，脊髓AMPA受體的功能會明顯升高，AMPA受體介導(dǎo)的興奮性突觸傳遞發(fā)生持久性的可塑性變化，最終導(dǎo)致慢性病理性疼痛的形成。

資料顯示:AMPA受體的功能異常，與AMPA受體在突觸中的表達(dá)數(shù)目、以及AMPA受體的亞基構(gòu)成(subunit composition)密切相關(guān)［1］。在成年動(dòng)物，脊髓背角AMPA受體主要是由GluR1、GluR2、GluR3亞基組合形成的四聚體，其中最常見的受體由2個(gè)GluR2和2個(gè) GluR1、或者是2個(gè) GluR2和2個(gè)GluR3所組成。GluR2作為構(gòu)成AMPA受體的關(guān)鍵組分，不僅能夠通過細(xì)胞內(nèi)的突觸輸送(synaptic trafficking)過程，調(diào)節(jié)AMPA受體的突觸含量，而且決定著AMPA受體的一系列生理生化特征，如AMPA受體的鈣通透性、內(nèi)向整流特性等。已有研究提示:GluR2可能參與慢性炎性疼痛過程［2］。但外周組織損傷是否直接調(diào)節(jié)脊髓GluR2的突觸表達(dá)而促進(jìn)中樞敏感化的形成，至今尚不清楚。

為探討AMPA受體在突觸中的表達(dá)變化與炎性疼痛形成的關(guān)系，本研究建立完全弗氏佐劑(CFA)炎性疼痛模型，觀察GluR2亞基在脊髓突觸中的變化，并分析慢性炎性疼痛中的一個(gè)關(guān)鍵激酶——cAMP 依賴性蛋白激酶(PKA)［3］在此過程中的可能作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物昆明種成年小鼠(♂，20～22g)，由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2試劑完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA;Sigma);PKA抑制劑H-89(Sigma);鼠抗GluR2抗體(Millipore Corporation，Temecula，CA，USA)，鼠抗β-actin抗體(江蘇碧云天);辣根過氧化物(HRP)標(biāo)記二抗(Jackson Immunoresearch Laboratories，Baltimore，PA，USA);ECL發(fā)光試劑盒(江蘇碧云天)。

1.3疼痛模型制備［4］小鼠經(jīng)乙醚淺麻醉后，后足底二、三趾之間的皮下推入CFA 25 μl，對照組在相同部位注射等容量的生理鹽水。造模前、后進(jìn)行行為學(xué)測試。

1.4行為學(xué)測試及鞘內(nèi)給藥［5］采用Up-Down法測定 Von Frey纖維 (Stoelting，Wood Dale，IL，USA)誘發(fā)的縮足閾值(PWT)。鞘內(nèi)給藥采用經(jīng)皮直接注射法，動(dòng)物經(jīng)乙醚淺麻醉后，用25 μl的微量進(jìn)樣器于L5-L6棘突間隙經(jīng)皮穿刺，以進(jìn)針產(chǎn)生空洞感并伴隨動(dòng)物甩尾，作為針頭進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔的標(biāo)志，緩慢注射藥物5 μl，對照組注射同等體積的生理鹽水。

1.5亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離根據(jù)我們前期報(bào)道的方法［5］，動(dòng)物經(jīng)苯巴比妥鈉 (30 mg·kg-1)腹腔注射麻醉后，行錐板切開術(shù)，分離L4-L5節(jié)段脊髓。在4℃細(xì)胞裂解緩沖液中制備勻漿。勻漿液經(jīng)1 000×g離心10 min，取上清(S1);S1經(jīng)10 000×g離心15 min，收集富含突觸小體 (synaptosome)的沉淀P2;P2用含0.5%Triton X-100的細(xì)胞緩沖液裂解15 min后，32 000×g離心20 min，得到富含突觸后致密質(zhì)(PSD)的沉淀P3。以上操作均在4℃下進(jìn)行。P3經(jīng)重新懸浮后，加入4×樣品緩沖液，煮沸5 min，進(jìn)行Western blot檢測。

1.6免疫印跡用8%SDS-PAGE電泳分離蛋白;轉(zhuǎn)移到PVDF膜上;經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉30 min后，以相應(yīng)蛋白的抗體4℃孵育過夜;印跡膜經(jīng)洗滌后，用HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，以ECL發(fā)光試劑盒顯像;以Image J軟件進(jìn)行圖像分析。

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均以±s表示;采用One-way ANOVA、post-hoc Tukey HSD進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1CFA對小鼠縮足閾值的影響及其與PKA的關(guān)系行為學(xué)結(jié)果顯示:注射CFA后24 h，小鼠的縮足閾值低于生理鹽水對照組，提示機(jī)械性痛覺超敏的形成;此時(shí)，鞘內(nèi)注射PKA抑制劑H-89，則明顯提高炎性疼痛小鼠的縮足閾值，且其作用至少持續(xù)30 min(Fig 1)，提示PKA在炎性疼痛中的重要作用。

Fig 1 Effect of CFA on PWT of mice and its relation with PKA

2.2CFA對脊髓背角AMPA受體GluR2亞基突觸表達(dá)的影響及其與PKA的關(guān)系為探討AMPA受體在痛覺超敏中的作用，本試驗(yàn)在注射CFA后24 h，分離脊髓背角，提取富含PSD的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，檢測AMPA受體GluR2亞基的突觸表達(dá)，發(fā)現(xiàn)炎性疼痛組動(dòng)物的GluR2突觸含量升高，與生理鹽水對照組相比，差異有顯著性(Fig 2)。而在注射CFA后24 h，鞘內(nèi)給予PKA抑制劑H-89處理脊髓30 min，發(fā)現(xiàn)H-89能降低GluR2的突觸含量(Fig 2)，和CFA組動(dòng)物相比較，差異有顯著性。與炎性疼痛動(dòng)物不同，正常小鼠鞘內(nèi)注射H-89后30 min，動(dòng)物的縮足閾值無變化(salinevsH-89:1.82±0.24 gvs1.72±0.15 g，P＞0.05，n=4);隨后的免疫印跡實(shí)驗(yàn)也顯示:H-89對正常小鼠GluR2的突觸含量無影響(Fig 3)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:外周組織損傷，可能通過激活脊髓背角PKA，提高AMPA受體GluR2亞基的突觸表達(dá)，從而參與痛覺超敏的形成。

Fig 2 Effect of CFA on synaptic content of GluR2 subunits and its relation with PKA.

3 討論

AMPA受體介導(dǎo)痛覺信息從外周向中樞的傳遞，并在病理性疼痛的形成中發(fā)揮重要作用。抑制AMPA受體的活性，能夠明顯緩解外周組織或神經(jīng)損傷誘發(fā)的痛覺超敏，而直接激動(dòng)脊髓AMPA受體甚至在正常動(dòng)物中也能誘發(fā)痛覺異常［6］。近年來大量的研究證實(shí):突觸后膜上AMPA受體的數(shù)目高度可變，這種動(dòng)態(tài)變化是突觸傳遞效率發(fā)生長時(shí)程改變的重要機(jī)制，并在學(xué)習(xí)、記憶以及許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中扮演關(guān)鍵角色。然而，對于AMPA受體在慢性炎性疼痛中的突觸表達(dá)變化，至目前為止尚存在很大爭議。曾經(jīng)有實(shí)驗(yàn)通過間接地檢測胞質(zhì)內(nèi)AMPA受體的含量［2］，發(fā)現(xiàn)外周組織損傷可能調(diào)節(jié)脊髓背角GluR2亞基的內(nèi)陷過程，影響AMPA受體的突觸表達(dá)。而本實(shí)驗(yàn)直接提取富含突觸后致密質(zhì)(PSD)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，測定炎性疼痛過程中GluR2的突觸含量，發(fā)現(xiàn)CFA在誘發(fā)痛覺超敏的同時(shí)，能夠明顯提高脊髓GluR2的突觸數(shù)目，說明痛覺超敏的形成與GluR2的突觸聚集密切相關(guān)。GluR2亞基的突觸表達(dá)增多，可能易化AMPA受體介導(dǎo)的痛覺信息的突觸傳遞，從而導(dǎo)致慢性疼痛的形成。

Fig 3 Intrathecal application of PKA inhibitor H-89(2.5 μg)for 30 min generated minimal effects on the synaptic contents of GluR2 subunits in spinal dorsal horn of intact mice.

大量的實(shí)驗(yàn)顯示:AMPA受體的突觸輸送過程，受到PKA、PKC(蛋白激酶C)等絲氨酸/蘇氨酸激酶、以及蛋白酪氨酸激酶(PTKs)的調(diào)控。在AMPA受體的GluR1亞基中，包含有PKC和PKA的磷酸化位點(diǎn)(分別為第831位絲氨酸和第845位絲氨酸)，PKC/PKA對GluR1的催化磷酸化，能夠提高GluR1在細(xì)胞膜表面及突觸中的表達(dá)，增強(qiáng)興奮性谷氨酸能突觸傳遞［7-8］。而在GluR2亞基的胞質(zhì)C-末端，則包含有多個(gè)酪氨酸的磷酸化位點(diǎn);Src家族酪氨酸激酶(SFKs)對GluR2的磷酸化，能夠調(diào)節(jié)GluR2與PDZ蛋白(如PICK1、GRIP1/2等)的結(jié)合，影響GluR2的內(nèi)陷過程，從而調(diào)節(jié)GluR2的突觸表達(dá)水平［9］。本文研究結(jié)果顯示:抑制PKA的活性，能夠明顯拮抗組織損傷誘發(fā)的GluR2亞基的突觸異常表達(dá)，且這一過程與炎性疼痛的緩解密切相關(guān)，提示脊髓PKA可能是促進(jìn)GluR2向突觸聚集的關(guān)鍵分子。而且我們的前期研究也顯示:PKA能夠激活脊髓背角Src家族酪氨酸激酶成員Fyn，參與脊髓背角痛覺信息的整合與調(diào)制［10］。因此，我們推測:PKA對GluR2突觸表達(dá)的調(diào)節(jié)，可能與Src家族酪氨酸激酶有關(guān)。但其具體的機(jī)制尚有待于進(jìn)一步的深入研究。

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