郝力力，李 銳

(1.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041;2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021)

日本血吸蟲病主要流行于中國、菲律賓和印度尼西亞，是所有人體血吸蟲病中對健康危害較嚴(yán)重的血吸蟲病。目前，我國血吸蟲病主要流行于長江流域及以南的湖南、湖北、江西、安徽、江蘇、浙江、云南等省、市、自治區(qū)，至2005年，在沿長江的省市仍有超過80萬的感染者［1］。長期以來，靠單一藥物治療很難有效地阻斷和控制血吸蟲病的傳播［2］，另外，在一些地區(qū)已出現(xiàn)對吡喹酮藥物敏感性下降的蟲株。目前控制血吸蟲病的主要技術(shù)問題是缺乏診斷感染者和評價(jià)療效的快速簡易的方法，以及缺乏有效疫苗［3］。開發(fā)新型診斷方法和疫苗的前提是對血吸蟲的基因表達(dá)調(diào)控、保護(hù)性免疫反應(yīng)機(jī)制、免疫逃避機(jī)制、新陳代謝及與宿主相互作用的基本生物學(xué)規(guī)律有深入的了解。

MicroRNA(miRNA)是由約22個(gè)核苷酸組成的非編碼的單鏈RNAs，是一類在真核物中新發(fā)現(xiàn)的基因表達(dá)調(diào)控因子，通過細(xì)胞和組織特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默或轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默模式，調(diào)節(jié)與個(gè)體生長、發(fā)育、疾病發(fā)生過程有關(guān)的基因的表達(dá)，參與早期發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡和脂肪代謝等一系列生物進(jìn)程。相對于線蟲等模式生物，日本血吸蟲 miRNA的鑒定較為困難，因?yàn)樾NA文庫中rRNA比例占到了65.63%，用傳統(tǒng)的克隆方法鑒定日本血吸蟲miRNA時(shí)檢出率低下。用Solexa等高通量測序技術(shù)能克服上述缺點(diǎn)［4］，因此，我們采用 Solexa高通量測序方法對日本血吸蟲miRNAs進(jìn)行鑒定，對日本吸血蟲基因組中轉(zhuǎn)錄的小RNA分子進(jìn)行系統(tǒng)的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲體收集

按常規(guī)方法逸出尾蚴，新西蘭大白兔經(jīng)腹部貼片感染約2500條尾蚴，42 d后頸動(dòng)脈放血處死兔子，解剖，打開胸腔，用門脈沖蟲法分別收集14 d童蟲和42 d的成蟲，去除受損傷的成蟲，將成蟲轉(zhuǎn)移到50mL的離心管，用1640完全培養(yǎng)基洗3遍，最后培養(yǎng)基的體積為10mL，加入100μL的蛋白酶抑制劑Cocktail，混勻后投入液氮速凍，轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱保存。

1.1.2 總RNA的提取

取適量的日本血吸蟲蟲體于1.5mL EP管中液氮研磨，應(yīng)用 Invitrogen公司的 Trizol Reagent提取，但在異丙醇沉淀時(shí)需-20℃過夜，方能徹底將小RNA完全沉淀。提取好的總RNA用DEPC水溶解后-80℃保存。

1.2 方法

1.2.1 小RNA文庫的制備

在15%的尿素變性聚丙烯酰胺凝膠上分離20μg的總 RNA，回收 18～30個(gè)堿基的片段，用Superscript II(invitrogen)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，而后分別將5'以及3'接頭連接于反轉(zhuǎn)錄后cDNA序列兩端，用Hotstart Phusion DNA Polymerase(NewEngland Lab，USA)在預(yù)設(shè)條件下進(jìn)行15個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，將得到的PCR產(chǎn)物在12%的尿素變性聚丙烯酰胺凝膠上分離回收，溶解于適當(dāng)體積的緩沖液中，得到小RNA送交華大基因進(jìn)行Solexa測序。

1.2.2 Solexa測序數(shù)據(jù)的分析

測序得到的序列，去除接頭序列信息，將unique read和日本血吸蟲基因組序列進(jìn)行比對，用Patscan程序?qū)⑴c基因組完全匹配的序列和Sanger miRBase數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對，預(yù)測保守的和日本血吸蟲特有的miRNAs，成蟲和童蟲 2個(gè)樣本之間miRNAs表達(dá)差異用IDEG6程序進(jìn)行分析，P＜0.01時(shí)被認(rèn)為表達(dá)差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量

Solexa測序結(jié)果 (表1)中，成蟲總共得到6400876條序列，童蟲得到5323610條序列;去除接頭污染，空載體，以及＜18 nt等不合格序列，最后成蟲和童蟲分別獲得了5349115和4273194條序列，分別占總序列的83.6%和80.3%。

表1 日本血吸蟲童蟲和成蟲Solexa測序的條數(shù)比例

2.2 種間保守miRNAs

發(fā)現(xiàn)16條保守的 miRNAs(表2)，其中 mir-71，mir-7，mir-2b，let-7在成蟲和童蟲中均測到較多的reads數(shù)，說明這4個(gè) miRNAs在童蟲和成蟲階段均高效表達(dá);而mir-124，mir-36aMir-10，mir-129在童蟲和成蟲階段測到的reads數(shù)則相對較少，可能預(yù)示其轉(zhuǎn)錄豐度也相對較低。

表2 日本血吸蟲中發(fā)現(xiàn)的16條保守miRNAs

2.3 日本血吸蟲特有miRNAs

結(jié)果 (表3)發(fā)現(xiàn)20條日本血吸蟲特有的miRNAs，其中 Novel-16，Novel-137，Novel-148在成蟲和童蟲階段測到的條數(shù)均較多，同樣說明這3個(gè)miRNAs在成蟲和童蟲階段表達(dá)豐度均較高，而Novel-110在成蟲階段表達(dá)測到了6477條，在童蟲階段只測到6條。同樣，Novel-70在成蟲階段測到了843條，童蟲階段只測到1條，說明Novel-110和Novel-70的表達(dá)可能和成蟲階段某些基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控有著密切聯(lián)系。

表3 18條高表達(dá)日本血吸蟲特有的miRNAs

3 小結(jié)與討論

Solexa測序技術(shù)比傳統(tǒng)的cDNA文庫構(gòu)建能檢測到更多的miRNAs［5-8］，傳統(tǒng)的克隆方法鑒定日本血吸蟲 miRNA最大的局限性在于檢出率低下［6］，Xue等［8］所構(gòu)建的尾蚴期小 RNA文庫所得序列經(jīng)對比均為rRNA或tRNA分子片段;成蟲期小RNA文庫所得序列中65.63%為rRNA片段，3.52%為mRNA片段，僅 24.24%為 ncRNA(非編碼RNA);且最終從55條ncRNA中僅鑒定出5個(gè)miRNA分子，存在這一問題的主要原因是由于血吸蟲rRNA大亞基存在著 “nick in vivo”現(xiàn)象［7］，28S大亞基的降解導(dǎo)致rRNA片段占有很大的比例，嚴(yán)重干擾miRNA的檢出率。而Solexa測序后每次配對末端運(yùn)行后可以得到超過3Gb的高品質(zhì)過濾數(shù)據(jù)，不僅可屏蔽掉日本血吸蟲rRNA的嚴(yán)重干擾，而且能檢測出于表達(dá)豐度極低的miRNA以及miRNA*。本研究采用Soolexa高通量測序技術(shù)對日本血吸蟲miRNAs進(jìn)行鑒定，將原先發(fā)現(xiàn)的5條miRNAs增至34條，為更好地了解日本血吸蟲不同發(fā)育階段轉(zhuǎn)化與基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)系，也為闡明日本血吸蟲的生長、發(fā)育、與宿主的相互作用關(guān)系以及為新型藥物靶點(diǎn)和候選抗原分子的發(fā)現(xiàn)奠定一定基礎(chǔ)。

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