吳安國(guó)，曾 寶，2，王春玲，陳建南，賴小平，2

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥開發(fā)研究中心，廣東廣州 510006;2.東莞廣州中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院，廣東東莞 523808)

黃連習(xí)稱“味連”、“雅連”、“云連”。3種黃連均含有多種生物堿，其中主要生物堿為小檗堿(berberine)。其具有廣譜抗生素的作用，在臨床上長(zhǎng)期以來(lái)用于降熱鎮(zhèn)痛、抗腸道細(xì)菌感染，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)黃連還具有抗癌［1－2］、抗放射及促進(jìn)細(xì)胞代謝、抗心律失常、調(diào)血脂［3］、抗糖尿病腎?。?］、預(yù)防骨質(zhì)疏松癥［5］、降血糖、抗血小板聚集等藥理作用。Sakuri等［6］利用同位素標(biāo)記的方法對(duì)大鼠口服小檗堿后進(jìn)行研究，結(jié)果表明小檗堿在胃腸道吸收不好;而且也有黃連素給狗口服吸收較差的報(bào)道［7］。Caco-2模型作為研究藥物體外吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)的有效工具能夠有效地預(yù)測(cè)藥物在體內(nèi)的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)情況。本實(shí)驗(yàn)將系統(tǒng)考察小檗堿在Caco-2模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)比較小檗堿單體與黃連提取物中的小檗堿轉(zhuǎn)運(yùn)的差異，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討影響中藥提取物在體內(nèi)吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)的因素。

1 儀器與材料

LC-20A高效液相色譜儀(日本島津);電子天平(十萬(wàn)分之一)(D2251，廣州市正一科技有限公司);CO2培養(yǎng)箱(CO-150，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司);雙人單面凈化工作臺(tái)(SW-CJ-2JD，蘇州凈化設(shè)備有限公司);倒置顯微鏡(OlympusIX2-SP，日本);細(xì)胞電阻儀(Millicell-ERS，美國(guó))。Caco-2細(xì)胞株(中科院上海細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞代數(shù):40～50)，小檗堿(批號(hào)110713-200609，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所);甲醇、乙腈為色譜純(德國(guó)默克公司);12孔Transwell培養(yǎng)板、75 cm2培養(yǎng)瓶〔購(gòu)自Corning-Costar(Cambridge，MA，USA)〕公司;DMEM 培養(yǎng)基(Dulbecco's Modifled Eagle's Medium，Gibco)HBSS(實(shí)驗(yàn)室配制)。

2 方法

2.1樣品的配制

2.1.1儲(chǔ)備液的配制精密稱取小檗堿對(duì)照品適量，加HBSS溶解并定容至10 ml，摩爾濃度為1 mmol·L－1，作為小檗堿儲(chǔ)備液。

2.1.2維拉帕米溶液的配制精密稱取維拉帕米適量，加甲醇溶解并定容至10 ml，摩爾濃度為20 mmol·L－1，精密吸取維拉帕米甲醇溶液適量，用pH=7.4的HBSS定容至50 ml的容量瓶中，最終濃度為 200 μmol·L－1，作為維拉帕米儲(chǔ)備液。

2.1.3小檗堿HBSS樣品的配制精密吸取儲(chǔ)備液適量，加pH=7.4的HBSS定容至刻度，配制成10、20、50、80、100、150、200、300、400μmol·L－1不同濃度的樣品。

Fig 1 HPLC chromatograms of blank Hanks buffer solution(HBSS)(A)，blank HBSS with bererine(B)and sample(C)

2.1.4含維拉帕米的樣品溶液精密吸取維拉帕米儲(chǔ)備液5 ml、不同體積的小檗堿儲(chǔ)備液置10 ml的容量瓶中，加pH=7.4的HBSS定容至10 ml。

2.1.5不同pH的小檗堿溶液的配制將 pH=7.4的HBSS溶液用HCl和NaOH溶液分別調(diào)節(jié)pH為5和9，按照“2.1.3”項(xiàng)的樣品配制法配制不同pH的樣品。

2.1.6黃連提取物中不同濃度的小檗堿溶液的配制稱取適量藥材，用10、8、6倍量的水分別提取3次，每次1 h，合并提取液，過濾，濃縮至干，加HBSS溶解，應(yīng)用 HPLC 定量至 50 μmol·L－1。

2.2細(xì)胞毒性試驗(yàn)將Caco-2細(xì)胞懸液接種于滅菌處理的96孔板中，每孔加100 μl，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后加入樣品溶液，并設(shè)對(duì)照孔，孵育4 h后吸出溶液加入MTT，再培養(yǎng)4 h，吸掉上清液，加入DMSO，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔值。記錄結(jié)果，得到細(xì)胞的安全濃度。

2.3雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)待Transwell板培養(yǎng)至d 21，各份溶液除菌后，用預(yù)熱的pH 7.4的HBSS洗生長(zhǎng)有Caco-2的Transwell板兩次。對(duì)于從AP側(cè)到BL側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn):將0.5 ml的樣品溶液加到AP側(cè)作為供給池，在BL側(cè)加入1.5 ml空白的HBSS作為接受池;對(duì)于從BL側(cè)到AP側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn):將1.5 ml樣品液加到BL側(cè)作為供給池，0.5 ml空白的HBSS加到AP側(cè)作為接受池，把Transwell培養(yǎng)板置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中，分別在 30、60、90、120 min 吸取接收室的轉(zhuǎn)運(yùn)液0.5 ml(AP→BL)、0.25 ml(BL→AP)，同時(shí)補(bǔ)加相應(yīng)37℃空白pH 7.4的HBSS液，冷藏備用。

2.4分析方法的建立

2.4.1色譜條件色譜柱:Kromasil 100-5 C18(250 mm ×4.5 mm，5 μm)，流動(dòng)相:乙腈 ∶0.3% 磷酸溶液(三乙胺調(diào)節(jié)pH為4)=35∶65，流速為1 ml·min－1，柱溫:25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm

2.4.2樣品處理取樣品溶液8 000 r·min－1離心10 min，吸取上清液，進(jìn)樣。

2.4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立精密量取儲(chǔ)備液適量，按照“2.1.3”樣品配制方法配成摩爾濃度為200、100、80、40、20、2 μmol·L－1的一系列摩爾濃度，樣品溶液按“2.4.2樣品處理”項(xiàng)操作后進(jìn)樣。結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=13256X－1321.7(r=0.999 9)。HPLC圖譜見Fig 1。

2.4.4精密度和穩(wěn)定性考察小檗堿200、100、50 μmol·L－1高、中、低3個(gè)不同濃度的精密度和穩(wěn)定性，3個(gè)不同濃度的精密度的 RSD值分別為0.10%、0.20%、1.45%，穩(wěn)定性的 RSD值分別為0.26%、0.10%、0.41%，表明此方法適合于小檗堿的含量測(cè)定。

2.5計(jì)算Papp值藥物透過Caco-2細(xì)胞單層的表觀穿透系數(shù)用Papp值作為參考，計(jì)算下式:Papp=dQ/(dt·A·C0)cm/s。其中dQ(nmol)為dt(s)內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)量，(cm2)為膜面積，C0(nmol·L－1)為在 Caco-2單層細(xì)胞的頂側(cè)或腸腔側(cè)的藥物初濃度。兩側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)率比值Pratio的計(jì)算公式:Pratio=Papp，(BL→AP)/Papp，(AP→BL)。其中Papp，(BL→AP)和Papp，(AP→BL)分別為雙向表觀滲透系數(shù)。

3 結(jié)果

3.1小檗堿單體跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)

3.1.1時(shí)間及濃度對(duì)小檗堿轉(zhuǎn)運(yùn)的影響從Fig 2，3中可以看出在相同濃度條件下，小檗堿的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)量呈增長(zhǎng)趨勢(shì);Fig 4中小檗堿的轉(zhuǎn)運(yùn)速率隨濃度而增加，說明其轉(zhuǎn)運(yùn)速率主要受濃度驅(qū)使;小檗堿在BL→AP方向的轉(zhuǎn)運(yùn)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于AP→BL方向的轉(zhuǎn)運(yùn)量，說明小檗堿的轉(zhuǎn)運(yùn)有一定的方向性;小檗堿的Pratio值隨濃度的增加而提高(Tab 1)。綜合上述結(jié)果說明小檗堿在AP→BL方向的轉(zhuǎn)運(yùn)方式可能以被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)為主，BL→AP方向的轉(zhuǎn)運(yùn)方式可能是有載體參與的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。

Tab 1 Effects of concentration on the Pappof berberine

3.1.2抑制劑維拉帕米對(duì)小檗堿轉(zhuǎn)運(yùn)的影響從Tab 2可以看出維拉帕米對(duì)小檗堿AP→BL方向的轉(zhuǎn)運(yùn)量沒有明顯影響，但是可以明顯減少BL→AP方向的轉(zhuǎn)運(yùn)量，說明小檗堿可能受到P-gp的調(diào)控作用。

Fig 2 Effects of the time on the transport of berberine(AP→BL)

Fig 3 Effects of the time on the transport of berberine(BL→AP)

Fig 4 Transport rate of berberine with different concentrations(AP→BL)

Tab 2 Effects of verapamil on the Pappof berberine

3.1.3溫度對(duì)小檗堿轉(zhuǎn)運(yùn)的影響由于溫度主要影響轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性，同時(shí)影響藥物在溶劑的狀態(tài)(小檗堿在低溫時(shí)的溶解度減少)，因此對(duì)藥物在Caco-2細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)生重要影響。從Tab 3可以看出在4℃時(shí)，小檗堿在BL→AP方向的轉(zhuǎn)運(yùn)量急劇下降，其Papp值從(111.20±2.72)×10－7減少到(12.72±0.60)×10－7。說明小檗堿在 BL→AP方向的轉(zhuǎn)運(yùn)以主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)為主。

Tab 3 Effects of temperature on the Pappof berberine

3.1.4pH對(duì)小檗堿轉(zhuǎn)運(yùn)的影響從Tab 4可以看出小檗堿在偏酸的HBSS中的轉(zhuǎn)運(yùn)量最高，小檗堿屬于生物堿類，這結(jié)果可能與小檗堿的性質(zhì)有關(guān)。

Tab 4 Effects of pH on the Papp(AP→BL)of berberine

Tab 5 Pappvalue of berberine as single compound and that of berberine being in extract

3.2黃連提取物中的小檗堿跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)同時(shí)比較了小檗堿單體與黃連提取物中的小檗堿的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，小檗堿的摩爾濃度均為50 μmol·L－1，從 Tab 5中可以看出小檗堿在AP→BL和BL→AP方向的Papp值都明顯減少，說明黃連提取物中的其他生物堿與小檗堿競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)運(yùn)，在AP→BL方向可能是對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)通道的競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)運(yùn)，在BL→AP方向則主要對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)運(yùn)。

4 討論

Caco-2細(xì)胞來(lái)源于人類結(jié)腸癌細(xì)胞，其結(jié)構(gòu)和生化特點(diǎn)類似于人類小腸上皮細(xì)胞，含有與小腸刷狀緣上皮相關(guān)的酶，能夠在細(xì)胞水平提供關(guān)于藥物分子通過小腸黏膜的吸收、代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)信息［8］。許多研究表明［9－10］，細(xì)胞模型與整體吸收有良好的相關(guān)性。是研究藥物吸收機(jī)制，預(yù)測(cè)口服藥物體內(nèi)吸收、生物利用度、安全性以及新藥劑型設(shè)計(jì)的良好工具。為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性還需進(jìn)一步與整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相結(jié)合，為新劑型的設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)在系統(tǒng)考察小檗堿在Caco-2的轉(zhuǎn)運(yùn)方式的同時(shí)比較了小檗堿單體與黃連提取物中小檗堿的轉(zhuǎn)運(yùn)的差異，表明了中藥提取物中化學(xué)成分的復(fù)雜多樣化使得影響小檗堿的轉(zhuǎn)運(yùn)的因素也多樣化，出現(xiàn)了中藥提取物中的化學(xué)成分在Caco-2模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)跟中藥配伍一樣有相互促進(jìn)或者相互抑制現(xiàn)象，對(duì)于應(yīng)用Caco-2模型來(lái)探討中藥提取物在體外的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)有待進(jìn)一步的研究。

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