史愛華，張建偉，沈 佳，姜北宇，章振華，李 林，景小冬

（北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097）

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）是嚴(yán)重危害家禽和野禽的一種烈性傳染性病原，其中H9N2亞型低致病力禽流感（LPAI）病毒雖致病力較低，但依然是威脅我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的最重要疫病之一［1］。姜北宇等［2］對(duì)禽流感 H9亞型流行毒株進(jìn)行了交叉保護(hù)試驗(yàn)。近幾年來H9N2亞型禽流感在免疫雞群中時(shí)有發(fā)生［3］，嚴(yán)重制約著我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。葉柱德等［4］對(duì)H9N2禽流感疫苗的研究進(jìn)行了綜述。常規(guī)的禽流感疫苗生產(chǎn)過程中，雞胚是禽流感病毒最為常用的一種培養(yǎng)基質(zhì)，但用雞胚尿囊液制備抗原過程中禽流感病毒易引起抗原性變異；大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)還存在雞胚數(shù)量不足和潛在外源病毒污染的問題［5］。以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為基質(zhì)制備疫苗具有無外源因子污染、易于規(guī)模化生產(chǎn)、可以較好的維持病毒抗原穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。許多學(xué)者［6－10］利用 MDCK細(xì)胞制備人流感疫苗做了大量研究，制備的疫苗可產(chǎn)生與雞胚苗同樣的免疫效果。在利用生物反應(yīng)器進(jìn)行病毒增殖時(shí)，不同病毒株、病毒接種劑量均非常重要，而且無法進(jìn)行病毒接種后的預(yù)吸附過程。本研究通過對(duì)不同病毒株、不同接種劑量以及病毒與細(xì)胞的吸附處理分別進(jìn)行篩選和優(yōu)化，以期獲得H9N2亞型禽流感病毒在MDCK細(xì)胞中增殖的最佳條件，為將來利用傳代細(xì)胞系在生物反應(yīng)器中大規(guī)模制備禽流感疫苗提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 禽流感病毒H9N2亞型地方分離毒株：A／Chicken／Hebei／WD／98（H9N2）株 （簡(jiǎn) 稱WD98株），由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所免疫預(yù)防研究室1998年從河北省望都分離；A／Chicken／Henan／QX／04（H9N2）株（簡(jiǎn)稱 HN04株），由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)王澤霖教授惠贈(zèng)；A／Chicken／Hebei／ZD／04（H9N2）株（簡(jiǎn)稱ZD04株），由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所免疫預(yù)防研究室2004年從河北省正定分離。

1.1.2 細(xì)胞 MDCK細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，在北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所免疫預(yù)防研究室傳代培養(yǎng)至77代。

1.1.3 細(xì)胞培養(yǎng)液 生長(zhǎng)液為含100mL／L胎牛血清和100單位／mL青霉素－鏈霉素的DMEM；維持液為含10μg／mL胰蛋白酶的DMEM。

1.1.4 雞紅細(xì)胞懸液 10mL／L雞紅細(xì)胞懸液由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所免疫預(yù)防研究室采集成年公雞血液制備。

1.1.5 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基為 HyClone公司產(chǎn)品；胰酶為DIFCO公司產(chǎn)品；胎牛血清為GIB－CO公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板為COSTAR公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 MDCK細(xì)胞復(fù)蘇及傳代 自液氮中取出凍存的MDCK細(xì)胞，37℃溫水速溶，3 000r／min離心3min，棄上清，用含100mL／L胎牛血清的DMEM懸浮細(xì)胞團(tuán)塊，加入T25培養(yǎng)瓶中，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2溫箱培養(yǎng)。經(jīng)48h～72h后MDCK細(xì)胞長(zhǎng)成單層，棄上清用1mL EDTA－胰蛋白酶清洗細(xì)胞表面，然后加入0.5mL胰蛋白酶37℃消化2 min～5min，吹打分散細(xì)胞，分裝于細(xì)胞培養(yǎng)板或瓶中傳代，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% 的CO2溫箱培養(yǎng)。1.2.2 病毒稀釋 取無菌試管5支，每支加入4.5 mL DMEM，第1管加入0.5mL病毒原液混勻，吸取0.5mL稀釋的病毒液加入到第2管混勻，再吸取0.5mL稀釋的病毒液加入到第3管，以此類推至第5管。各試管中病毒液稀釋倍數(shù)分別為101、102、103、104、105。

1.2.3 病毒吸附試驗(yàn) 取長(zhǎng)成單層MDCK細(xì)胞的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，棄去生長(zhǎng)液，用DMEM沖洗一次，逐孔加入不同稀釋度的病毒懸液，每個(gè)稀釋度接種3孔，每孔接種0.2mL。非吸附組接種病毒后每孔立即加入1.8mL含有10μg／mL胰蛋白酶的DMEM維持液；吸附組接種病毒后置37℃溫箱吸附1h，然后每孔加入1.8mL含有10μg／mL胰蛋白酶的維持液。將兩組培養(yǎng)板置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔24h測(cè)定細(xì)胞上清液中病毒HA滴度，直至細(xì)胞脫落。

1.2.4 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn) 分別取病毒接種細(xì)胞后24、48、72、96、96h后收獲細(xì)胞并凍融1次的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用常規(guī)方法進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)，即在96孔V型板中加入50μL生理鹽水，與50μL待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清混勻后進(jìn)行倍比稀釋，并設(shè)陽性、陰性和空白對(duì)照孔。每孔中加入50μL 10mL／L雞紅細(xì)胞懸液，混勻后靜置室溫15min～20min，觀察記錄結(jié)果。測(cè)定結(jié)果取以log2為底的倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1HN04株接種MDCK單層后培養(yǎng)液上清的HA滴度

病毒不論吸附與否，感染后24h病毒滴度均為0，48h后病毒滴度顯著升高，72h達(dá)到高峰；病毒稀釋倍數(shù)為103和104時(shí)病毒滴度較高。細(xì)胞凍融后病毒滴度較凍融前明顯升高（表1）。

2.2 WD株接種MDCK單層后培養(yǎng)液上清的HA滴度

WD株在接種后96h的HA滴度達(dá)到最高為5.3log2，病毒液經(jīng)103稀釋后吸附組與未吸附組的病毒滴度無顯著差異，而104稀釋接種后吸附組較未吸附組的病毒滴度稍高（表2）。

2.3 ZD04株接種 MDCK單層后培養(yǎng)液上清的HA滴度

ZD04株接種MDCK細(xì)胞后病毒滴度測(cè)定結(jié)果較其他2株明顯較低，最高HA滴度為4log2，提示不同分離株在MDCK細(xì)胞中的增值能力存在差異。吸附組與非吸附組的病毒滴度無顯著差異。凍融前后HA滴度也未出現(xiàn)顯著差異。

表1 H9N2禽流感病毒HN04株接種MDCK后培養(yǎng)液上清的HA滴度（log2）Table 1 HA titer of the supernatant of MDCK cells with inoculation of H9N2avian influenza virus isolate HN04

表2 WD株接種MDCK后培養(yǎng)液上清的HA滴度（（log2）Table 2 HA titer of the supernatant of MDCK cells with inoculation of H9N2avian influenza virus isolate WD

表3 ZD04株接種MDCK后培養(yǎng)液上清的HA滴度（（log2）Table 3 HA titer of the supernatant of MDCK cells with inoculation of H9N2avian influenza virus isolate ZD04

3 討論

H9N2亞型禽流感病毒的最佳接種濃度，試驗(yàn)中選用了3個(gè)低致病力的H9N2亞型禽流感病毒株，均以103～104倍稀釋的病毒液接種滴度最高，這種結(jié)果與雞胚培養(yǎng)病毒的接種后的病毒滴度類似，毒力較強(qiáng)的ZD04株經(jīng)過凍融后病毒培養(yǎng)液HA滴度較低為3log2～4log2（1∶8～1∶16），毒力較弱的HN04和WD株的HA滴度為4.3log2～6log2（1∶19.7～1∶64），這可能與病毒的毒力強(qiáng)致使細(xì)胞受到損害較快，而不能增殖病毒有關(guān)。李春艷等［11］在利用微載體規(guī)?；囵B(yǎng) MDCK細(xì)胞增殖H9N2亞型禽流感病毒的研究中，接毒劑量為MOI＝0.025，培養(yǎng)液pH7.4時(shí)，H9N2亞型禽流感病毒HA滴度可達(dá)到9log2（1∶512），我們認(rèn)為這與利用微載體培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞密度較高從而使得病毒濃度較高有關(guān)，高密度培養(yǎng)可以大大提高病毒的滴度。

吸附與否對(duì)HA影響，劉麗玲等［12］在進(jìn)行禽流感病毒接種時(shí)進(jìn)行吸附，吸附時(shí)間為1h，H9N2亞型病毒的滴度為7log2，楊琴等［13］利用雞胚成纖維細(xì)胞、VERO細(xì)胞和MDCK細(xì)胞對(duì)禽流感病毒進(jìn)行了增殖研究，結(jié)果顯示病毒接種后吸附90min的HA滴度最高，可達(dá)到9log2。趙斌秀等［14］研究MDCK細(xì)胞接種流感病毒并吸附2h，維持液中含有10μg／mL胰蛋白酶時(shí)，上清的HA滴度可達(dá)到7 log2。本試驗(yàn)結(jié)果為3株H9N2亞型病毒株病毒液上清HA最高滴度為6log2，病毒滴度稍低，可能是接種的病毒毒株差異或者是培養(yǎng)條件差異造成。為了將來在生物反應(yīng)器中更為方便的接種，本研究進(jìn)行了不吸附試驗(yàn)，通過試驗(yàn)證明通過接種前對(duì)細(xì)胞單層進(jìn)行洗滌后，再接種流感病毒，不進(jìn)行吸附與進(jìn)行吸附都可以使HA達(dá)到較高的滴度，二者沒有顯著區(qū)別。

HA滴度出現(xiàn)的時(shí)間，將稀釋的病毒接種長(zhǎng)成單層的MDCK細(xì)胞，不經(jīng)吸附，加入含有不同胰蛋白酶濃度的MDCK作為維持液，測(cè)定接種病毒后不同時(shí)間培養(yǎng)液上清中的HA滴度，在72h達(dá)到最高值；戚鳳春等［15］報(bào)道流感病毒接種 MDCK細(xì)胞后HA峰值時(shí)間為60h～72h，劉麗玲等［12］報(bào)道，將雞胚毒H9N2病毒接種MDCK細(xì)胞，吸附1h，維持液胰蛋白酶含量為1‰，72hHA 滴度達(dá)到峰值7 log2，以后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而略有下降，病毒滴度下降可能是病毒致使細(xì)胞病變脫落后病毒不能增殖造成。造成HA滴度出現(xiàn)不同的原因可能有以下幾個(gè)方面，一是選用的毒株不同，不同毒株對(duì)MDCK細(xì)胞的致病作用不同；二是本研究采用了MDCK適應(yīng)2代后的流感病毒，而劉麗玲等使用的是雞胚毒。

綜上所述，低致病力禽流感病毒可以在MDCK細(xì)胞上大量增殖，病毒的最佳接種濃度為103～104倍稀釋病毒。細(xì)胞單層經(jīng)過清洗后，接種病毒吸附與不吸附均可以產(chǎn)生良好病變和HA滴度。病毒的最佳收獲時(shí)間為72h～96h。

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