楊建泉，錢 琨，顧丙泉，王明珍，金文杰，秦愛建＊

（1.禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009；2.江蘇如東縣畜牧獸醫(yī)站，江蘇南通 226400；3.江蘇省南通市動(dòng)植物進(jìn)出境檢疫局，江蘇南通 226000）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種以妊娠母豬嚴(yán)重繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀和高病死率為特征的傳染病。其病原PRRSV屬于套式病毒目（Nidovirales）、動(dòng)脈炎病毒科（Arteriviridae）、動(dòng)脈炎病毒屬（Arterivirus）成員。PRRSV的基因組為單股、不分節(jié)段的正鏈RNA，大小約15kb，包含有相互重疊的9個(gè)開放閱讀框（open reading frames，ORFs），分別為 ORF1a、ORF1b、ORF2－ORF7。其中 ORF1包括ORF1a和ORF1b，位于基因組的5′端，長約12kb，約占整個(gè)基因組的80%，編碼病毒復(fù)制所必需的非結(jié)構(gòu)蛋白（nonstructural proteins，Nsps）。ORF2－ORF7位于病毒基因組3′端，全長約3kb，占整個(gè)病毒基因組20%，是病毒基因組的結(jié)構(gòu)基因，主要編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5以及非糖基化囊膜基質(zhì)蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）［1］。

PRRS于1987年在美國的北卡羅納、衣阿華等州首先報(bào)道，不久即傳遍到了中西部，并在全美迅速蔓延。隨后加拿大、德國、荷蘭等一些國家先后暴發(fā)了該病。自1991年，亞洲地區(qū)的日本、韓國、菲律賓、我國臺(tái)灣等都相繼報(bào)道了該病［1］。我國大陸于1996年首次報(bào)道并分離到病毒［2］?，F(xiàn)在PRRS已經(jīng)成為世界性疾病，遍及世界各主要養(yǎng)豬國家與地區(qū)，并己成為危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一。2006年以來，我國暴發(fā)了一種以高熱、高發(fā)病率、高死亡率為特征的“豬高熱綜合征”。通過國內(nèi)學(xué)者的大量研究，證實(shí)高致病性PRRSV變異株是“豬高熱綜合癥”的主要病因。其病毒基因與典型PRRSV相比在多處發(fā)生了特異性的變異，因此高致病性PRRSV 有 時(shí) 也 稱 之 為 非 典 型 性 PRRSV［3－7］。PRRSV遺傳及抗原性差異很大且易發(fā)病毒間重組，導(dǎo)致病毒基因組極易發(fā)生變異，因此如何弄清當(dāng)前PRRSV流行毒株，特別是病毒ORFs的分子流行病學(xué)及變異規(guī)律，對(duì)有效診斷，并研制有針對(duì)性的疫苗，從而提高當(dāng)前PRRSV疫苗保護(hù)率有著至關(guān)重要的作用。

本研究以江蘇地區(qū)發(fā)病豬場(chǎng)為研究對(duì)象，發(fā)病現(xiàn)場(chǎng)采集病料分離病毒并鑒定，對(duì)不同分離株的分子遺傳特征進(jìn)行比較、分析，研究其遺傳變異規(guī)律。研究結(jié)果對(duì)選擇具有地方代表性的疫苗毒株，采取有針對(duì)性的措施來防控和消滅類似疫病的再次暴發(fā)和流行有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 病料來自規(guī)模豬場(chǎng)患病豬的新鮮淋巴結(jié)和肺臟組織以及2007年－2010年采集的江蘇不同地區(qū)發(fā)病豬的肺、脾、腎、淋巴結(jié)等組織病料。樣品采集地均暴發(fā)“豬高熱綜合征”，以患病豬體溫升高，大批懷孕母豬流產(chǎn)，斷奶仔豬死亡為主要特征，這些豬場(chǎng)均未免疫過PRRS疫苗。

1.1.2 細(xì)胞與病毒 Marc－145細(xì)胞由中國農(nóng)科院上海獸醫(yī)研究所袁世山研究員惠贈(zèng)；陽性對(duì)照J(rèn)Xwm06病毒液由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)楊漢春教授惠贈(zèng)。

1.1.3 主要試劑 高糖型DMEM為GIBCO公司產(chǎn)品；新生牛血清（NBS）為蘭州民海生物公司產(chǎn)品；RNasin Inhibitor、dNTP 、1kb DNA Marker、Taq DNA聚合酶為Fermentas公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄酶（MMLV）、T4DNA Ligase、pGEM T easy為Promega產(chǎn)品；AxyPrep Multisource Total RNA Miniprep Kit為美國AxyGEN公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000為TaKaRa公司產(chǎn)品；抗PRRSV N蛋白特異性單克隆抗體由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)楊漢春教授惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參考GenBank登陸的基因序列，在Nsp2基因缺失區(qū)的兩端保守區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，經(jīng)典毒株擴(kuò)增片段為734bp，而高致病性PRRSV擴(kuò)增片段為644bp，上游引物為Nsp2－F 5′－ATCCCAGCCGCTCTGGCCGAA－3′，下游引物為Nsp2－R 5′－GACAGGAGCTGCTTGATGACAC－3′；另外，參照PRRSV VR2332株和CH－1a株的全長基因組序列，將PRRSV的全長基因組分為13個(gè)相互重疊的基因片段，設(shè)計(jì)了13對(duì)引物（表1）用于病毒全基因組的擴(kuò)增。

1.2.3 病毒Nsp2基因和全序列基因組PCR擴(kuò)增按照AxyPrep Multisource Total RNA Miniprep Kit進(jìn)行病毒RNA的提取，并用 M－MLV reverse transcriptase（Promega，USA）進(jìn)行cDNA合成用于PCR擴(kuò)增。

1.2.3.1 Nsp2基因擴(kuò)增 取1μL cDNA為模板，依次加入10×buffer 5μL、Mg2＋4μL、dNTP（10 mmol／L）2μL、用于檢測(cè)PRRSV Nsp2基因片段的上下游引物 （25pmol／L）各1μL、Taq DNA 聚合酶（5U／μL）1μL，加超純水至總體積為50μL。反應(yīng)條件為：95℃5min；94℃1min，59℃1min，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。取PCR產(chǎn)物用10g／L瓊脂糖凝膠電泳回收純化陽性條帶連接到T載體，經(jīng)驗(yàn)證后送上海Invitrogen公司測(cè)序。

1.2.3.2 PRRSV全長基因的擴(kuò)增 PCR總體積采用50μL體系，依次加入以下試劑：10×PCR buffer 5μL、Mg2＋4μL、dNTPs（10mmol／L）2 μL、P1（25pmol／μL）1μL、P2（25pmol／μL）1μL、Taq DNA polymerase（5U／μL）1μL、cDNA 1μL，最后補(bǔ)加滅菌超純水至50μL，輕輕混勻后，按下列反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為95℃5min；94℃1min，根據(jù)各對(duì)引物的Tm值設(shè)置的退火溫度退火1min，72℃1.5min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。反應(yīng)產(chǎn)物用10g／L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收純化陽性條帶連接到T載體，經(jīng)驗(yàn)證后送上海Invitrogen公司測(cè)序。

1.2.4 病毒分離培養(yǎng) 無菌采集血液與組織病料。血液在4℃條件下，8 000r／min離心10min，收集上清接種細(xì)胞；采集的組織病料，加入3倍～5倍體積的DMEM培養(yǎng)基和青鏈霉素，用勻漿器研磨后，將組織勻漿凍融3次，然后于8 000r／min離心10 min，收集上清接種細(xì)胞。

表1 Nsp2部分基因及RD2007株病毒全基因組擴(kuò)增引物Table1 Primers used to amplify the whole genome of RD2007and partial Nsp2gene

Marc－145細(xì)胞長成單層后，棄上清，用超純水配制的PBS洗滌細(xì)胞表面，棄PBS洗液，接種1mL待檢樣品，37℃吸附2h，棄去樣品，添加含10 mL／L小牛血清的DMEM維持液，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中。連續(xù)培養(yǎng)6d～7d，每天觀察細(xì)胞病變情況。

1.2.5 間接免疫熒光鑒定 接種待檢病料的細(xì)胞孔待出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變時(shí)，棄去培養(yǎng)液，每孔加入200μL預(yù)冷的固定液（丙酮∶乙醇＝3∶2）固定5 min。棄去固定液，用PBS洗滌、置超凈臺(tái)吹干，4℃過夜，加入適當(dāng)稀釋的抗PRRSV N蛋白單抗，200 μL／孔，37℃溫育45min，PBS洗滌，加入200μL的1∶100稀釋的FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG（SIGMA），37℃溫育45min，用PBS洗滌3次，每次5min，熒光顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。

1.2.6 基因序列比對(duì)與分析 應(yīng)用DNA Star和MEGA 4軟件對(duì)測(cè)序序列連同已發(fā)表的PRRSV核苷酸序列進(jìn)行遺傳變異分析，確定PRRSV江蘇分離株與已發(fā)表的PRRSV核苷酸和氨基酸序列的同源性，同時(shí)繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 江蘇地區(qū)的PRRSV的PCR結(jié)果

利用材料方法中的Nsp2基因引物對(duì)臨床送檢病料進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，Nsp2－F和 Nsp2－R引物能夠從病料中特異性的擴(kuò)增出644bp大小的條帶，證實(shí)江蘇地區(qū)近年來仍然有高致病性PRRSV存在（圖1）。

2.2 臨床PRRSV分離與鑒定

將處理后的病料接種于Marc－145細(xì)胞分離病毒，觀察細(xì)胞病變并利用間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）和RT－PCR試驗(yàn)對(duì)分離病毒進(jìn)行鑒定，結(jié)果證實(shí)從臨床病料中分離得到了PRRSV，并命名為PRRSV RD2007株（圖2）。

2.3 PRRSV RD2007株基因組全序列測(cè)定及序列分析

經(jīng)PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化獲得全基因的13個(gè)片段（圖3），克隆測(cè)序，將獲得的序列信息拼接后，獲得PRRSV RD2007株的全基因組序列。PRRSV RD2007株基因組全長15 319bp，包含9個(gè)開放閱讀框，與美洲型分離株各個(gè)基因區(qū)段的長度相近，在Nsp2基因中有不連續(xù)的30個(gè)氨基酸的缺失。

圖1 部分臨床樣品的RT－PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 RT－PCR results of partial clinical samples

圖2 RD2007株病毒分離鑒定結(jié)果Fig.2 Identification results of PRRSV RD2007strain

圖3 PRRSV－RD－2007株各基因的分段擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Divided fragments of RD2007 genome for amplification

應(yīng)用DNA Star軟件對(duì)不同PRRSV分離株的各個(gè)開放閱讀框進(jìn)行序列同源性的分析。結(jié)果顯示，RD2007株與國內(nèi)外各美洲型分離株的全基因序列核苷酸同源性在88.8%～99.3%之間，而與歐洲型代表毒株LV的全基因序列核苷酸同源性只有60.7%比較結(jié)果。各個(gè)基因片段同源性分析顯示，PRRSV RD2007株的ORF1a同其他分離株相應(yīng)片段差異明顯，主要是因?yàn)镹sp2存在缺失引起的。與22個(gè)美洲型PRRSV代表毒株的ORF1a的核苷酸同源性在87.1%～99.1%。變異較大的蛋白還包括GP3和GP5，與22個(gè)美洲型PRRSV代表毒株的GP3和GP5的同源性分別在88.6%～100%和88.7%～99.5%之間。

將PRRSV RD2007株與其余34株P(guān)RRSV全長基因組序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，運(yùn)用DNA Star繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RD2007株與美洲型代表毒株VR－2332處于同一分支，與歐洲型代表毒株LV的遺傳距離較遠(yuǎn)，屬于美洲型毒株。同時(shí)與其他10株高致病性PRRSV（JXA1、HUN4、YN2008、Henan－1、HUB1、SY0608、LN、SHH、GDSD1、HEB1）的親緣關(guān)系最近（圖4）。

2.4 PRRSV RD2007株ORF5基因遺傳變異分析

PRRSV RD2007株ORF5基因由603bp組成，編碼201個(gè)氨基酸。氨基酸同源性序列比較分析表明，RD2007株與美洲型代表毒株VR－2332的氨基酸同源性是89.4%，與國內(nèi)最早分離到的PRRSV CH1a株和BJ－4株的氨基酸同源性分別為90.5%和86%。與高致病性PRRSV代表毒株JXA1、WUH1和HUN4的同源性分別是99.0%、99.5%和99.5%。然而與歐洲型PRRSV代表毒株LV株的氨基酸同源性只有59.2%。氨基酸序列分子遺傳比較分析，發(fā)現(xiàn)在GP5序列中存在兩個(gè)高變區(qū)，分別位于N端信號(hào)肽和抗原表位處。同時(shí)分離株的ORF5基因還存在較高的氨基酸點(diǎn)突變，突變位置主要集中于3位～39位N端信號(hào)肽區(qū)域附近。其中，13位與151位氨基酸均為R，具有強(qiáng)毒株的特征；分離株的L39突變?yōu)镮39，而位于中和表位之前一位非中和表位A29突變?yōu)閂29。

圖4 PRRSV分離株全長基因組序列的進(jìn)化樹分析Fig.4 Phylogenetic analysis based on full－length PRRSV RD2007sequence

3 討論

RT－PCR檢測(cè)結(jié)果顯示臨床病料中的病毒都為高致病性的PRRSV，包括分離株P(guān)RRSV RD2007株在內(nèi)，第481位氨基酸和533位～561位氨基酸都存在不連續(xù)的30個(gè)氨基酸缺失，Nsp2基因的這一特征與已報(bào)道的2006年以來在我國流行的高致病性PRRSV缺失部位完全一致，從而再一次證實(shí)PRRSV為“豬高熱綜合征”的主要病原［8－11］。試驗(yàn)結(jié)果還表明高致病性PRRSV仍然在江蘇部分地區(qū)存在，雖然大部分養(yǎng)殖場(chǎng)都已經(jīng)進(jìn)行了疫苗免疫，這可能與PRRSV各分離株之間存在著廣泛的抗原多樣性有關(guān)。

PRRSV各型不同毒株之間的變異率可以高達(dá)10%，而在PRRSV眾多編碼的蛋白中GP5是最容易發(fā)生變異的基因之一，GP5的變異主要集中在一級(jí)序列的變化，糖基化位點(diǎn)的缺失或修飾等方面［1］。本研究中江蘇地區(qū)分離株P(guān)RRSV RD2007ORF5編碼的氨基酸序列與其他23個(gè)國內(nèi)外毒株的ORF5的氨基酸序列進(jìn)行遺傳變異比較分析發(fā)現(xiàn)，與美洲型代表毒株VR－2332的氨基酸同源性是89.4%，與國內(nèi)最早分離到的PRRSV CH1a株和BJ－4株的氨基酸同源性分別為90.5%和86%。與高致病性PRRSV代表毒株JXA1、WUH1和HUN4的同源性分別是99.0%、99.5%和99.5%，然而與歐洲型PRRSV代表毒株LV株的氨基酸同源性只有59.2%，說明隨著時(shí)間的推移，PRRSV RD2007株病毒發(fā)生了變異。根據(jù)ORF5氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)分離到的PRRSV全基因組中ORF5基因存在較高的氨基酸點(diǎn)突變，突變位置主要集中于3～39位N端信號(hào)肽區(qū)域附近，與以往的報(bào)道一致［1，12］。其中，13位與151位氨基酸均為R，具有強(qiáng)毒株的特征；分離株的L39突變?yōu)镮39，而位于中和表位之前一位非中和表位A29突變?yōu)閂29，該非中和表位能夠延緩機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，從而可能促進(jìn)病毒逃避機(jī)體的體液免疫。造成這些突變的主要原因可能是在生存選擇的壓力下，病毒總是朝著有利于在宿主間傳播和在宿主體內(nèi)持續(xù)存在的方向變異。這些氨基酸的變異對(duì)GP5蛋白親水性、疏水性和抗原性等特性有何影響，是否會(huì)導(dǎo)致病毒毒力的變化還有待進(jìn)一步的研究與分析。通過對(duì)分離株RD2007的分子遺傳變異分析表明，其全長基因組序列與美洲型代表毒株VR－2332的同源性為89.2%，與歐洲型代表毒株LV的同源性為60.7%，而與高致病性PRRSV的同源性在98.5%～99.3%。從全基因組進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，美洲型毒株與歐洲型毒株分別處在兩個(gè)不同的分支。RD2007株與美洲型代表毒株VR－2332處于同一分支，與歐洲型代表毒株LV的遺傳距離較遠(yuǎn)，屬于美洲型毒株。在美洲型PRRSV分支中，2006年以來分離鑒定的高致病性PRRSV又處于同一個(gè)分支，顯示了較高的親緣關(guān)系，據(jù)此推測(cè)此分離毒株與高致病性PRRSV代表株可能有著共同的起源。

本研究利用RT－PCR方法檢測(cè)了2007年－2010年間江蘇省PRRSV流行情況，并分離了PRRSV RD2007毒株，進(jìn)行了全基因組分子遺傳變異的分析，為PRRSV的快速診斷和鑒定流行PRRSV的基因型奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為江蘇省PRRSV疫苗毒的選擇提供了依據(jù)。

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