張 鵬，黃 娟，陳 杰，蔣文明＊，陳繼明，單 虎

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）屬于正黏病毒科A型流感病毒屬，亞型眾多，根據(jù)致病力的差異可分為高致病性AIV和低致病性AIV［1］。高致病性AI在國(guó)內(nèi)外頻頻暴發(fā)，不僅給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的損失，同時(shí)也威脅人類的健康，從而引起了人們的高度重視。低致病性AIV 雖對(duì)動(dòng)物多呈低致病性，但具有分布廣泛的特點(diǎn)，能夠使產(chǎn)蛋量下降，造成宿主的免疫抑制以及可以與其他病原微生物發(fā)生協(xié)同作用，引起繼發(fā)感染，其危害也不容忽視［2］。

H4亞型AIV是一種低致病性毒株，多從水禽和野鳥體內(nèi)分離到，在鴨、鵝和鳥等體內(nèi)持續(xù)存在，并且可能傳播給雞［2－3］，雞感染后不引起明顯的臨床疾病或死亡，只能觀察到輕微病變或弱血清陽(yáng)轉(zhuǎn)，但是會(huì)持續(xù)排毒，這給雞群禽流感的控制帶來(lái)了困難［3］。H4亞型AIV感染后，可再次感染H5、H9或其他亞型AIV，在宿主體內(nèi)可能發(fā)生復(fù)雜的基因重組，產(chǎn)生新型的重組病毒。1999年，加拿大報(bào)道了從患有肺炎的豬體內(nèi)分離到H4N6亞型AIV［4］，我國(guó)豬群也受到H4亞型AIV的威脅［5］，表明該亞型病毒也可以在種間傳播。因此，有必要對(duì)H4亞型AIV加強(qiáng)監(jiān)測(cè)。

國(guó)內(nèi)自20世紀(jì)80年代起雖不斷有分離到H4亞型AIV的報(bào)道，但是大多通過(guò)血清學(xué)進(jìn)行亞型鑒定的［6－8］。NCBI流感病毒數(shù)據(jù)庫(kù)收錄了來(lái)自中國(guó)內(nèi)地的H4亞型AIV 18株，其中，提交了血凝素（hemagglutinin，HA）全基因序列的僅有8株，即 A／mallard／PoyangLake／15／2007（H4N6）（FJ428583），A／mallard／Yanchen／2005（H4N6）（EU880342），A／duck／Nanchang／4165／2000（H4N6）（CY006017），A／duck／PoyangLake／FB13／2007 （ H4N6 ）（FJ439566 ）， A／mallard／PoyangLake／P17／2007（H4N6）（FJ439565），A／mallard／Zhalong／88／2004（H4N6）（FJ349247），A／duck／Hunan／819／2009（H4N2）（HQ285886），A／duck／Guangxi／912／2008（H4N2）（CY076892），這些毒株全部來(lái)源于鴨和野鴨，尚無(wú)雞源H4亞型AIV分離株的HA全基因序列。

本研究對(duì)新分離的3株雞源H4亞型AIV進(jìn)行了HA基因的全序列測(cè)定及分析，為進(jìn)一步了解H4亞型AIV的來(lái)源和進(jìn)化特征，探討其分子演化規(guī)律提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 2010年10月份全國(guó)禽病流行病學(xué)調(diào)查中，自安徽省某雞場(chǎng)采集的雞口腔和泄殖腔拭子（由中國(guó)流行病學(xué)與動(dòng)物衛(wèi)生中心提供），拭子裝在含有抗生素的PBS甘油采樣液中。

1.1.2 SPF雞胚 SPF雞胚購(gòu)自北京梅里亞公司。

1.1.3 主要試劑 RNAiso Plus和RNA病毒一步法PCR試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。DNA膠回收試劑盒為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司產(chǎn)品。

1.1.4 引物 根據(jù)A型流感病毒血凝素（HA）基因片段兩端的核苷酸保守序列，采用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。上 游 引 物 P1： 5 ＇－TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGGG－3＇，下 游 引 物 P2：5＇－ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGT GTTTT－3＇，預(yù)期PCR產(chǎn)物大小為1 750bp。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離 將采集的拭子以10 000r／min離心5min，每個(gè)拭子取上清液經(jīng)尿囊腔接種兩枚9日齡SPF雞胚，37℃培養(yǎng)，每24h觀察一次，收集24 h～72h自然死亡和未死亡雞胚尿囊液，置－70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RNA提取 取300μL尿囊液到800μL RNAiso Plus中混勻，靜置5min；加入250μL氯仿，振蕩混勻，靜置5min；4℃、12 000r／min離心15 min；小心吸取上清540μL，加入等體積的異丙醇，混勻，－20℃靜置2h～3h，以沉淀 RNA；4℃、12 000 r／min離心10min，棄上清；加入1mL濃度為750 mL／L的乙醇洗滌1次；4℃、8 000r／min離心5 min；棄上清，干燥，用20μL DEPC水溶解RNA，置－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 HA基因的擴(kuò)增、克隆與測(cè)序 按照RNA病毒一步法PCR試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作，PCR條件為：50℃30min，94℃2min，94℃30s，57℃30s，72℃2min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。DNA片段回收后與pMD18－T載體連接后轉(zhuǎn)化，經(jīng)氨芐平板篩選出陽(yáng)性質(zhì)粒，鑒定后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 序列分析和比較 用DNA Star軟件對(duì)測(cè)定的病毒HA基因全長(zhǎng)序列進(jìn)行分析，并與GenBank中的中國(guó)分離株進(jìn)行比較。所用到的毒株有A／mallard／PoyangLake／15／2007（H4N6）（FJ428583），A／mallard／Yanchen／2005（H4N6）（EU880342），A／duck／Nanchang／4165／2000（H4N6）（CY006017），A／duck／PoyangLake／FB13／2007 （ H4N6 ）（FJ439566 ）， A／mallard／PoyangLake／P17／2007（H4N6）（FJ439565），A／mallard／Zhalong／88／2004（H4N6）（FJ349247），A／duck／Hunan／819／2009（H4N2）（HQ285886），A／duck／Guangxi／912／2008（H4N2）（CY076892）。

1.2.5 國(guó)內(nèi)外H4亞型AIV分離株HA基因序列比較 根據(jù)已測(cè)得的HA基因序列，在NCBI的Influenza Virus Resource數(shù)據(jù)庫(kù)里，搜索所有其收錄H4亞型的基因序列，對(duì)于同一國(guó)家或地區(qū)，同一年份或相似年份，同一H亞型隨機(jī)選取一株，共選取42株序列，應(yīng)用MEGA5軟件對(duì)所測(cè)得的序列和在NCBI數(shù)據(jù)里選定的序列進(jìn)行比較，構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 HA基因的RT－PCR擴(kuò)增與克隆測(cè)序

從尿囊液提取的RNA模板中擴(kuò)增得到HA基因片段，10g／L的瓊脂糖凝膠電泳證明獲得了與預(yù)期1 750bp左右的片段大小相符的清晰的、單一條帶。將純化的PCR產(chǎn)物克隆到pMD18－T載體并測(cè)序，通過(guò)序列比對(duì)可鑒定為H4亞型禽流感病毒，毒株命 名 為 A／chicken／Anhui／AB22／2010、A／chicken／Anhui／AB29／2010， A／chicken／Anhui／AB30／2010。

2.2 序列分析結(jié)果

用DNA Star分析序列可得，A／chicken／Anhui／AB22／2010，A／chicken／Anhui／AB30／2010 和 A／chicken／Anhui／AB29／2010的 HA 基因編碼區(qū)均由1 738個(gè)核苷酸組成，有一個(gè)開放閱讀框（ORF），大小為1 605bp，編碼535個(gè)氨基酸。

推導(dǎo)的氨基酸序列分析表明，A／chicken／Anhui／AB22／2010和 A／chicken／Anhui／AB29／2010兩株毒株含有5個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，其中4個(gè)位于HA1部分（15aa～17aa、31aa～33aa、175aa～177aa、307aa～309aa），1個(gè)位于 HA2部分（494aa～496aa）。A／chicken／Anhui／AB30／2010含有6個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，其中5個(gè)位于HA1部分（11aa～13aa、15aa～17aa、31aa～33aa、175aa～177aa、307aa～309aa），1個(gè)位于HA2部分（494aa～496aa）。3株毒株的裂解位點(diǎn)處氨基酸均為PEKASRG，均符合典型的低致病性AIV特征（表1）。

2.3 3個(gè)分離株與國(guó)內(nèi)毒株HA基因序列比較

通過(guò)MEGA軟件運(yùn)算可得A／chicken／Anhui／AB22／2010，A／chicken／Anhui／AB29／2010 和 A／chicken／Anhui／AB30／2010 3株分離株之間的同源性在99%以上，與國(guó)內(nèi)報(bào)道毒株的同源性在80%到90%之間，但與來(lái)自湖南的毒株 A／duck／Hunan／819／2009（H4N2）遺傳距離在0.02以下，即同源性在98%以上（表2）。

表1 HA基因幾個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)的分析Table 1 Amino acids in the key sites of the HA gene of 3isolates

表2 分離株與國(guó)內(nèi)報(bào)道毒株的遺傳距離Table 2 Genetic distance of isolates and domestic reported strains

2.4 國(guó)內(nèi)外H4亞型AIV分離株HA基因序列比較

用MEGA5軟件繪制出的進(jìn)化樹（圖1），從進(jìn)化樹上看，全球H4亞型存在著差異較大的兩個(gè)譜系，即西半球譜系（h4.1譜系）和東半球譜系（h4.2譜系），并且這兩個(gè)較大的分支演變出了很多個(gè)亞分支。中國(guó)內(nèi)地分離株分別處于h4.2.3（亞洲）分支和h4.2.6分支（歐亞）上，3個(gè)分離株與湖南的毒株A／duck／Hunan／819／2009（H4N2）同處于東半球譜系的歐亞分支上。

圖1 全球H4亞型禽流感病毒進(jìn)化分析（箭頭所指為分離株）Fig.1 Phylogenetic analysis of global H4AIV（the arrows indicate isolates）

3 討論

HA是AIV表面的一種糖蛋白，是AIV亞型或新變種的主要標(biāo)志，其裂解位點(diǎn)的序列直接影響毒株致病力的高低［9］。因此，研究HA基因有助于了解AIV的特征和來(lái)源，從而進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分析、評(píng)估和疾病預(yù)報(bào)預(yù)警。HA上裂解位點(diǎn)及糖基化位點(diǎn)的突變則有可能導(dǎo)致病毒毒力發(fā)生根本性的變化。所有高致病力病毒在這一區(qū)域都含有多個(gè)堿性氨基酸序列［10］，而低致病力毒株這一區(qū)域常含有一個(gè)精氨酸，在本研究中，3個(gè)H4亞型分離株裂解位點(diǎn)處氨基酸序列為PEKASR，僅含有1個(gè)精氨酸，為低致病性AIV的特征序列。3個(gè)分離株與A／duck／Hunan／819／2009（H4N2）親緣關(guān)系很近，同源率可達(dá)98.4%以上，說(shuō)明這些病毒可能由同一祖先演化而來(lái)。發(fā)生在HA受體結(jié)合位點(diǎn)上的突變有時(shí)可能改變病毒的宿主特異性，Allen C等［11］報(bào)道，H4亞型AIV 226位氨基酸由Gln（Q）突變?yōu)長(zhǎng)eu（L），可提高對(duì)2，6－linkage唾液酸受體的結(jié)合活性，從而增加感染豬或人的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)所分離的3株H4亞型AIV此位點(diǎn)的分析表明，均為Asn（N），這種突變是否會(huì)影響病毒的毒力和宿主特性，當(dāng)該病毒感染雞是否會(huì)造成流行，仍需進(jìn)一步的研究。

在遺傳演化上，AIV的多數(shù)基因一般都可分為兩個(gè)譜系，即東半球譜系和西半球譜系［12－13］。我們的分析結(jié)果顯示，全球H4亞型的HIV確實(shí)存在著兩個(gè)差別較大的譜系，西半球譜系和東半球譜系。我國(guó)國(guó)內(nèi)分離株分別處于東半球譜系h4.2.3（亞洲）分支和h4.2.6分支（歐亞）上，其中，3株分離株處于東半球譜系的歐亞分支上，且與A／duck／Hunan／819／2009處于同一分支。東半球譜系相對(duì)于西半球譜系來(lái)說(shuō)分支較為復(fù)雜，組間的同源性也比較低。H4亞型AIV多分離自水禽和野鳥，野生水禽（特別是野鴨）可將病毒傳給家養(yǎng)水禽，家養(yǎng)水禽再將病毒傳給陸生家禽，使病毒在陸生家禽之間傳播，而且病毒還可回傳給家養(yǎng)水禽，豐富了家養(yǎng)水禽的基因庫(kù)，增加了病毒發(fā)生基因重組的機(jī)會(huì)［14］，因此應(yīng)加強(qiáng)對(duì)家養(yǎng)水禽（尤其是家鴨）的監(jiān)測(cè)。

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