文攀,陳永敢,陳光宙,梁妙芳,林應(yīng)耀

(瓊州學院生物科學與技術(shù)學院,海南 五指山 572200)

現(xiàn)代研究表明,靈芝(Ganoderma)具有多種生理活性和藥理作用,目前已分離出150余種活性成分,主要有多糖類、核苷類、生物堿類、氨基酸蛋白質(zhì)類、三萜類和多種微量元素等[1]。其中,靈芝多糖是靈芝新的主要活性成分,它能提高機體免疫力,刺激干擾素的形成,抗病毒,抗氧化,抗腫瘤,提高機體耐缺氧能力,增強肝臟、骨髓、血液合成DNA、RAN和蛋白質(zhì)的能力,從而延長壽命等多種功能[2-5]。近年來靈芝多糖以其獨特的保健功能成為研究的熱點。

靈芝多糖含量的多少,已成為衡量靈芝品質(zhì)的指標之一。目前關(guān)于野生靈芝與人工栽培靈芝兩者之間多糖含量的研究報道較少。靈芝是有靈芝菌絲經(jīng)過生長發(fā)育而形成的,本研究對野生靈芝和人工栽培靈芝的菌絲多糖含量進行測定比較,探索用人工栽培靈芝替代野生靈芝的可行性,同時也為尖峰嶺地區(qū)靈芝多糖方面的研究提供相關(guān)資料[6]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

供試材料:野生靈芝(jfl3和jfl5)均由陳光宙老師采自尖峰嶺,hz5(從人工栽培基地引種)(以上三種靈芝均由瓊州學院生物科學與技術(shù)學院林應(yīng)耀教授鑒定)。各級菌絲、馬鈴薯、瓊脂、木屑、玉米粉、麥麩石膏等培養(yǎng)基材料均從本地購買。

藥品和試劑:蒽酮、葡萄糖、95%酒精、濃硫酸。以上藥品均為分析純;實驗測定用水均為蒸餾水;培養(yǎng)基配制用水均為雙重蒸餾水。

儀器:1810-B型英自動雙重純水蒸餾器,江蘇省金壇市恒豐儀器廠;BL-50A型立式壓力蒸汽滅菌器,上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;skfe-01型電熱恒溫鼓風干燥箱,湖北省黃石市醫(yī)療器械廠;B-220型恒溫水浴鍋,上海亞榮生化儀器廠;800型離心沉淀器,上海手術(shù)器械廠;UV-2100型光束紫外可見分光光度計,北京瑞利分析儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 菌絲的制備

1.2.1.1 一級菌絲的制備。一級菌絲的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。具體操作過程為:先取800mL左右水置于鍋中煮沸,取200g去皮馬鈴薯,切成絲狀,放入沸水中,煮沸20min,用紗布過濾,去渣,得到馬鈴薯汁;加入適量水煮融瓊脂,并用玻璃棒不斷攪拌,且加熱溫度不宜過高,以免瓊脂煮糊。煮融瓊脂后,把過濾所得的馬鈴薯汁加入其中,同時加入所稱好的葡萄糖,攪拌均勻,將配好的培養(yǎng)基迅速倒出,定容至1000mL,攪拌均勻后快速分裝在玻璃瓶中,以免培養(yǎng)基凝固。1000mL的培養(yǎng)基分裝成40瓶。將分裝好的培養(yǎng)基擰緊蓋子,在121℃,壓強為0.1MPa的高壓高溫滅菌鍋中滅菌20min。20min后將培養(yǎng)基取出,放入接種室冷卻至室溫[7]。

接種時,將經(jīng)過高壓滅菌的工具(解剖刀和鑷子)在酒精燈的外焰灼燒消毒、冷卻,在酒精燈火焰上方進行接種操作。每種菌絲轉(zhuǎn)接6瓶,并進行3個重復(fù)。

1.2.1.2 二級菌絲的制備。當一級菌絲完全覆蓋培養(yǎng)基表面時(約15d左右),用來轉(zhuǎn)接至二級培養(yǎng)基中。

二級培養(yǎng)基的配方為:木屑78%+麥麩20%+蔗糖1%+石膏1%+水。本實驗需要干料5kg,將配料混勻后分裝至玻璃瓶中,每500g干料培養(yǎng)基可以分裝至8～10瓶,并在裝好培養(yǎng)基的瓶子中央扎孔,擰緊蓋,在溫度為121℃、壓強為0.1MPa的高溫高壓滅菌鍋中滅菌30min。30min后取出,放入接種室冷卻至室溫。

接種時,將經(jīng)過高壓滅菌的工具(解剖刀和鑷子)在酒精燈的火焰上方灼燒消毒、冷卻,在酒精燈火焰上方進行接種操作。每種菌絲轉(zhuǎn)接6瓶,并進行3個重復(fù)。

1.2.1.3 三級菌絲的制備。當二級培養(yǎng)基中的菌絲長滿滿瓶時(約25d),用來進行三級種的制備。三級培養(yǎng)基的配方為:木屑73%+玉米粉5%+麥麩20%+蔗糖1%+石膏1%+水。本實驗需要5kg干料,將配料混勻后采用袋裝的方式分裝,分裝后扎孔。蓋好蓋,在溫度為121℃、壓強為0.1MPa的高溫高壓滅菌鍋中滅菌2h。之后將培養(yǎng)基取出,放入接種室冷卻至室溫。

接種時,將經(jīng)過高壓滅菌的工具(解剖刀和鑷子)在酒精燈的外焰灼燒消毒、冷卻,在酒精燈火焰上方進行接種操作。每個菌株的二級菌絲每瓶轉(zhuǎn)接4袋,并做3個重復(fù)。

1.2.2 各靈芝菌絲多糖待測液的制備

本試驗采用傳統(tǒng)的靈芝多糖提取方法:熱水浸提法。將培養(yǎng)至生理成熟的各株各級靈芝菌絲(生理成熟的標志是培養(yǎng)基表面出現(xiàn)白色或黃色突起的疙瘩塊)挑取出來[8],在65℃的電熱恒溫鼓風干燥箱烘至恒重。

分別從各菌種一級種的6瓶菌絲中進行挑取,混合后烘干,剪碎混勻并分別稱取0.2g,裝入試管中,再加入15mL 95%的酒精,蓋好試管蓋,于78℃的恒溫水浴鍋中水浴 30min,然后在3000r/min的離心機離心30 min。除去上清液,重復(fù)上述操作3次。除去上清液后,在試管中加入15mL蒸餾水,蓋好試管蓋,在沸水中加熱 1h,然后在 3000r/min的離心機中離心30min。收集上清液并定容至100mL,搖勻,得到一級菌絲多糖待測液。

分別從各菌種二級種和三級種的6瓶菌絲進行挑取,然后分別混合并烘干,分別剪碎混勻并稱取0.2g,裝入試管中,然后,按照上述各菌種一級種菌絲的制作方法分別制取二級菌絲和三級菌絲的待測液。

1.2.3 葡萄糖標準曲線的制作

取適量的葡萄糖在105℃的恒溫箱中烘至恒重,取0.5g,用蒸餾水溶解,定容至50mL,從中取出1mL定容至50mL,得到200μ g/mL的葡萄糖溶液[9]。將配制好的葡萄糖溶液按表1取,制備葡萄糖標準溶液。

表1 葡萄糖標準溶液的制取

蒽酮試劑:0.1g蒽酮溶于106mL硫酸溶液中(硫酸溶液的配制為 76mL濃硫酸加30mL水)?，F(xiàn)配現(xiàn)用。取6根試管,按表1取葡萄糖溶液和蒸餾水,之后每根試管中加入5mL蒽酮試劑,搖勻,沸水浴10min,再冰水浴10min,在625nm處測定吸光值[10]。

1.2.4 各靈芝菌絲多糖含量的測定

靈芝菌絲多糖含量的測定用蒽酮-硫酸法。蒽酮試劑現(xiàn)配現(xiàn)用。取各菌絲多糖待測液1mL,分別加入蒽酮試劑5mL,在沸水中顯色10min,之后立即放入冰水中,冰水浴10min,取出,測定各靈芝菌絲多糖溶液在625nm處的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線的測定

按1.2.3方法測定吸光值,以葡萄糖濃度(μ g/mL)為橫坐標,吸光值(A)為縱坐標,繪制標準曲線,如圖1所示,葡萄糖濃度與吸光值線性關(guān)系良好。經(jīng)線性回歸,得回歸方程為 A=0.0056C+0.0172,R=0.9991。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 靈芝菌絲多糖含量的測定結(jié)果

2.2.1 jfl3靈芝菌絲多糖含量的測定結(jié)果

由表2可以看出,就每種靈芝菌絲的多糖含量來說,jfl3、jfl5和hz5靈芝一級菌絲的多糖含量分別是2.563%、5.413%和1.92%;二級菌絲的多糖含量分別是0.590%、1.011%和0.571%;三級菌絲的多糖含量分別是0.342%、0.561%和0.531%。一級菌絲的多糖含量最高,二級菌絲的多糖含量次之,三級菌絲的多糖含量最少。就野生種靈芝和人工栽培種靈芝來說,在一級菌絲中野生種(jfl3和jfl5)的多糖含量分別是2.563%和5.413%,而人工栽培種hz5的多糖含量是1.92%,野生種的多糖含量比人工栽培種多3倍;在二級菌絲中,其含量相差最多約2倍,在三級菌絲中,其含量jfl5和hz5相差不多,而且jfl3的多糖含量比hz5少。

表2 各種靈芝各級菌絲多糖含量(%)

將上述測定結(jié)果如圖2所示:

圖2 各級各株靈芝菌絲的多糖含量

從圖2中可以看出,野生靈芝和人工栽培靈芝在栽培過程中,各級菌絲的多糖含量均是從多到少。從一級菌絲到二級菌絲,野生種的多糖含量急劇下降,人工栽培種的下降幅度不大。從二級種到三級種菌絲的多糖含量雖有所降低,但變化不大。不同的靈芝中其含量變化也是不同的。

3 結(jié)論

從本試驗的研究結(jié)果可以看出,野生靈芝菌絲的多糖含量比人工栽培靈芝菌絲的多糖含量高,野生靈芝經(jīng)栽培后菌絲的多糖含量會降低,降低至與人工栽培靈芝菌絲的多糖含量相近。人工栽培靈芝菌絲中是含有多糖的,但含量不高,這與前人所說的野生靈芝的藥用價值要高于人工栽培的結(jié)果一致[11]。

人工栽培靈芝菌絲多糖含量不高的原因是多方面的,主要與其生長環(huán)境不同有關(guān),可能也與靈芝的種源不同有關(guān)。

目前,由于對野生靈芝資源的過度開發(fā)和市場對靈芝需求量的增加,單靠野生靈芝是不能滿足人們對醫(yī)療保健的需求的。人工栽培靈芝的菌絲多糖含量雖不及野生靈芝,但也可利用來制取醫(yī)藥和保健品,從而滿足人們健康生活的需要。因此,發(fā)展人工栽培靈芝是可行的。

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